《Renal Failure》：Exacerbation of renal interstitial fibrosis by the UHRF1/G9a axis through epigenetic silencing of KLF15
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肾纤维化是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的核心病理驱动因素，但其表观遗传机制尚未完全阐明。本研究揭示了含有泛素样PHD和RING指结构域1（Ubiquitin-like with PHD and RING Finger do
肾纤维化是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的核心病理驱动因素，但其表观遗传机制尚未完全阐明。本研究揭示了含有泛素样PHD和RING指结构域1（Ubiquitin-like with PHD and RING Finger domains 1，UHRF1）/G9a轴在这一过程中的关键作用。研究人员通过多种实验方法证明，在CKD患者和相关小鼠模型的纤维化肾脏以及活化的肾成纤维细胞中，UHRF1和组蛋白甲基转移酶G9a均显著上调。成纤维细胞特异性敲除UHRF1可显著减轻肾纤维化，并同时抑制G9a的表达和酶活性。从机制上讲，研究人员揭示了UHRF1/G9a轴与抗纤维化基因Krüppel样因子15（Krüppel-like factor 15，KLF15）启动子处抑制性组蛋白H3赖氨酸9单/二甲基化（histone H3 lysine 9 mono-/di-methylation，H3K9me1/me2）标记的沉积相关的病理机制，这一点得到了染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（chromatin immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction，ChIP-qPCR）和靶向切割与标签化（cleavage under targets and tagmentation，CUT&Tag）实验的支持，从而导致KLF15转录沉默。抑制该轴后恢复KLF15蛋白表达有助于改善纤维化。总之，研究结果表明UHRF1/G9a表观遗传复合物是肾纤维化的关键调节因子，并强调了其作为缓解肾纤维化新靶点的潜力。
研究背景与科学问题
慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是全球性的公共卫生负担，患病率约为8%–14%。肾小管间质和肾小球成纤维细胞的增殖及其进展为间质纤维化是CKD的标志性病理改变。成纤维细胞的活化与增殖与纤维化严重程度和CKD进展速率密切相关，因此靶向成纤维细胞活化是抗纤维化研究的重点。
含有泛素样PHD和RING指结构域1（Ubiquitin-like with PHD and RING Finger domains 1，UHRF1）是一种多结构域蛋白，能够介导DNA甲基化、组蛋白甲基化等多种表观遗传过程，被认为是表观遗传调控中枢。既往研究已证实UHRF1可通过调控靶基因（如Krüppel样因子15（Krüppel-like factor 15，KLF15））的DNA甲基化促进肾纤维化，但其是否通过组蛋白甲基化等其他表观遗传机制发挥促纤维化作用尚不清楚。
KLF15是在肾脏高表达的抗纤维化因子，可抑制I型胶原表达并调控Wnt/β-catenin和MAPK信号通路。G9a（即常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2，EHMT2））是一种主要催化组蛋白H3赖氨酸9单/二甲基化（histone H3 lysine 9 mono-/di-methylation，H3K9me1/me2）的组蛋白甲基转移酶，其在肾纤维化中的促进作用已被逐步认识。已有研究表明UHRF1可与G9a形成复合物介导转录抑制相关的H3K9甲基化，但该复合物在肾纤维化中的作用及其下游靶基因尚待探索。
基于此，研究人员提出假说：UHRF1介导G9a催化KLF15启动子处的H3K9甲基化，导致其表观遗传沉默，从而加剧肾纤维化。本研究旨在探讨破坏UHRF1-G9a-KLF15轴能否缓解肾纤维化。
研究方法概述
研究人员使用了来自复旦大学附属中山医院2021年6月至2022年12月期间CKD各期患者的肾活检样本（共36例，每期6例，伦理批号B2021-346R）。动物实验采用雄性C57BL/6小鼠建立单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）和单侧缺血再灌注（unilateral ischemia-reperfusion，UIR）两种肾纤维化模型。体外实验以大鼠正常肾成纤维细胞系NRK-49F为模型，使用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激活化。关键技术包括：利用GEO公共数据库（GSE66494、GSE269356、GSE299417、GSE293589）进行转录组分析；通过Col1a2-Cre/ERT2小鼠与UHRF1flox/flox小鼠交配构建成纤维细胞特异性UHRF1敲除小鼠；使用G9a抑制剂BIX-01294进行药理学干预；运用分子对接（GRAMM-X）和分子动力学模拟（GROMACS 2025.3）预测蛋白质相互作用；采用Western blot、免疫组织化学、免疫荧光、Masson三色染色进行蛋白表达和组织学评估；应用染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（chromatin immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction，ChIP-qPCR）和靶向切割与标签化（cleavage under targets and tagmentation，CUT&Tag）检测组蛋白修饰富集情况；通过免疫共沉淀验证蛋白相互作用；使用siRNA敲低和过表达质粒进行功能验证。
研究结果
UHRF1和G9a的共同上调与慢性肾脏病严重程度相关
通过分析GSE66494数据集发现，CKD患者肾脏组织中UHRF1和G9a的mRNA水平较健康对照显著升高。对36例不同分期CKD患者的肾活检组织进行免疫组化分析显示，随着CKD分期加重，UHRF1和G9a蛋白表达以及H3K9me1和H3K9me2水平逐渐升高，而H3K9me3和SETDB1无显著变化。相关性分析表明，UHRF1与G9a表达呈强正相关，且两者均与血清肌酐、血尿素氮、纤维化面积、H3K9me1和H3K9me2呈正相关，与估算肾小球滤过率呈负相关。
UHRF1/G9a表观遗传轴在实验性肾纤维化和TGF-β1刺激的成纤维细胞中上调
在UUO和UIR小鼠模型中，纤维化肾脏的UHRF1和G9a蛋白表达显著增加。免疫荧光显示G9a与PDGFRα+β+细胞及AQP1+细胞共定位，而UHRF1主要定位于PDGFRα+β+细胞，且G9a与UHRF1存在明显共定位。纤维化肾脏中H3K9me1和H3K9me2水平显著升高，H3K9me3无显著变化。在TGF-β1刺激的NRK-49F细胞中，UHRF1和G9a蛋白表达以及H3K9me1/me2水平均显著上调。
UHRF1在肾纤维化中调控G9a的表达和酶活性
成纤维细胞特异性UHRF1敲除小鼠在UUO和UIR模型中均表现出纤维化显著减轻，伴随G9a蛋白水平下降以及H3K9me1/me2水平降低。在TGF-β1刺激的NRK-49F细胞中，siRNA敲低UHRF1同样使G9a蛋白表达和H3K9me1/me2水平下降，且G9a相对酶活性也显著降低。
UHRF1的SRA和RING结构域对其与G9a的相互作用至关重要
分子对接和分子动力学模拟预测人、小鼠和大鼠的UHRF1-G9a复合物结合自由能分别为-14.2、-13.2和-6.2 kcal/mol，表明存在稳定的跨物种保守结合。免疫共沉淀实验证实，缺失SRA和RING结构域的UHRF1截短突变体与G9a的结合能力显著低于全长UHRF1。功能验证显示，转入截短突变体的TGF-β1刺激的NRK-49F细胞中G9a表达和纤维化标志物水平均显著降低。
G9a是UHRF1介导肾纤维化的关键下游效应分子
使用G9a抑制剂BIX-01294（2 mg/kg/天腹腔注射）处理UUO和UIR模型小鼠，可显著减轻肾纤维化，降低α-SMA和纤连蛋白表达，并减少H3K9me1/me2水平。在体外，siRNA敲低G9a或BIX-01294处理均可抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞活化和H3K9me1/me2水平。BIX-01294不影响UHRF1表达，而G9a过表达可部分逆转UHRF1敲低的抗纤维化效果，表明G9a作用于UHRF1下游。
UHRF1-G9a促进KLF15启动子的H3K9甲基化和KLF15转录抑制
公共数据库分析显示KLF15在多个纤维化模型中转录水平下调。在UUO和UIR模型中，KLF15蛋白表达被抑制，而BIX-01294治疗可部分恢复其表达。ChIP-qPCR显示纤维化肾脏中KLF15启动子处H3K9me1/me2富集增加，成纤维细胞特异性UHRF1敲除可逆转这一现象。体外实验中，KLF15过表达可部分逆转TGF-β1诱导的纤维化标志物上调，G9a敲低可阻止TGF-β1引起的KLF15下调。CUT&Tag实验证实UHRF1敲低减少了活化成纤维细胞中KLF15启动子处的H3K9me1/me2富集。挽救实验表明，UHRF1敲低可上调KLF15表达，而同时过表达G9a可部分消除此效应，且G9a过表达不影响UHRF1蛋白水平。
讨论与结论
讨论部分指出，尽管CKD病因多样，肾纤维化是其共同的病理终点，活化成纤维细胞是驱动细胞外基质过度沉积的核心效应细胞。本研究将UHRF1在肾纤维化中的功能从DNA甲基化调控拓展至组蛋白甲基化领域，证明UHRF1通过其SRA和RING结构域与G9a功能性相互作用，调控G9a的表达和酶活性，共同驱动KLF15启动子处H3K9me1/me2沉积，导致其转录沉默。研究还发现单独抑制G9a即可在不依赖UHRF1的情况下缓解纤维化，这可能与G9a自身的甲基转移酶活性及其可能参与DNA甲基化的功能有关。KLF15被确认为该轴的关键下游候选基因之一，但UHRF1-G9a轴的调控网络可能远不止于此。研究局限性包括：未探索G9a介导的DNA甲基化在肾纤维化中的作用；未研究UHRF1的PHD和TTD结构域的功能；体内验证依赖系统性药理学抑制而非成纤维细胞特异性基因敲除；未在其他肾细胞类型中验证该轴的作用；尚无UHRF1或G9a抑制剂进入临床试验。
研究结论翻译：这项工作定义了以UHRF1/G9a轴为核心的肾纤维化关键致病表观遗传回路。研究人员证明UHRF1影响G9a的表达和活性，UHRF1-G9a介导H3K9me1/me2依赖性的KLF15沉默，这与肾纤维化背景下成纤维细胞活化和基质沉积相关。重要的是，对该轴的多个节点（包括UHRF1、G9a或其相互作用）进行抑制均可有效改善纤维化。研究结果完善了UHRF1作为整合多种抑制性染色质修饰的主调控因子的理论框架，并强调了破坏UHRF1/G9a复合物以缓解肾纤维化的潜力。
