《Renal Failure》：Integrative transcriptomic and single-cell analyses identify CD74 as a candidate regulator of ferroptosis in renal tubular cells during nephrolithiasis
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肾结石的发病率持续上升且复发率高，肾小管上皮细胞损伤是其病理核心环节。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，已被证实参与多种肾脏疾病，但其在肾结石中的作用尚不明确。本研究探讨了CD74是否与肾结石过程中铁死亡相关的肾小管
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肾结石的发病率持续上升且复发率高，肾小管上皮细胞损伤是其病理核心环节。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，已被证实参与多种肾脏疾病，但其在肾结石中的作用尚不明确。本研究探讨了CD74是否与肾结石过程中铁死亡相关的肾小管损伤有关，并探索了NF-κB信号的潜在参与。研究人员通过乙醛酸盐诱导的小鼠模型观察到显著的草酸钙沉积、肾功能受损、ACSL4与GPX4表达改变以及氧化应激增强。通过整合批量转录组学、蛋白质-蛋白质相互作用网络、生物信息学分析及公共单细胞RNA测序数据集，研究人员将CD74鉴定为候选铁死亡相关基因，其在肾结石进展过程中表达升高。在体外实验中，草酸盐处理人HK-2细胞可诱导CD74上调，并伴随铁死亡相关的分子与生化改变。CD74敲低可改善细胞活力与氧化还原稳态，并减弱铁死亡相关标志物的变化；而CD74过表达则加重氧化损伤与铁死亡。机制上，CD74调控与NF-κB信号活性的改变相关，且对NF-κB进行药理学调节可部分逆转相应的细胞表型。综上所述，这些发现支持CD74相关的NF-κB信号在肾结石铁死亡相关肾小管损伤中的潜在作用，提示CD74/NF-κB轴可能代表一个潜在的治疗方向，并为未来研究提供机制见解。
论文解读
一、研究背景与研究目的
肾结石是全球范围内发病率持续上升的重大泌尿系统疾病，其五年内复发率高达约50%。当前临床治疗主要聚焦于结石的物理清除与症状缓解，缺乏针对结石形成和肾损伤的有效药物干预手段，导致患者疾病负担沉重、生活质量显著下降。草酸钙晶体在体内的沉积被认为是肾结石形成的核心事件，这些晶体在肾小管中积聚，造成肾小管上皮细胞损伤，释放炎症介质并激活肾间质纤维化，最终导致慢性肾功能障碍。因此，深入理解肾小管上皮细胞损伤的分子机制对于阐明肾结石发病机制和开发靶向治疗策略至关重要。
铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以过度脂质过氧化、氧化还原失衡和抗氧化防御系统受损为特征。铁死亡已被证实在急性肾损伤、缺血再灌注损伤和糖尿病肾病等多种肾脏疾病中发挥关键作用，且近期研究表明铁死亡参与草酸钙诱导的肾小管损伤和肾结石进展。然而，连接氧化应激、炎症信号与铁死亡相关肾小管上皮细胞损伤的上游调控网络仍不完全清楚。
CD74又称MHC II类恒定链，最初被鉴定为参与抗原呈递的跨膜蛋白，是巨噬细胞迁移抑制因子的主要受体，参与免疫调节、细胞增殖、炎症和组织修复。在肾脏病理中，CD74表达与肾小管上皮细胞损伤和炎症密切相关，但CD74在铁死亡调控中的作用尚不明确，其在肾结石相关铁死亡中的功能也尚未被系统研究。基于初步转录组和单细胞分析中CD74在肾结石模型中表达升高且与铁死亡相关转录特征变化一致的观察，研究人员提出假设：CD74可能通过调控NF-κB信号参与肾结石过程中铁死亡相关的肾小管损伤。
二、主要技术方法
研究人员采用了多层次的整合研究策略。在体内层面，建立了乙醛酸盐诱导的C57BL/6小鼠肾结石模型，通过Von Kossa染色观察晶体沉积，检测血清肾功能指标，并利用免疫组化评估铁死亡相关蛋白表达。在转录组层面，对小鼠肾组织进行批量转录组测序，通过差异表达分析、GO功能富集和KEGG通路分析筛选候选基因，并与FerrDb数据库铁死亡相关基因取交集，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，利用四种cytoHubba算法鉴定核心枢纽基因。在单细胞层面，整合公共小鼠肾脏单细胞RNA测序数据集进行细胞类型注释和铁死亡模块评分。在体外层面，使用人肾近端肾小管上皮细胞系HK-2建立草酸盐损伤模型，通过siRNA敲低和质粒过表达进行功能获得与丧失研究，采用CCK-8检测细胞活力，测定MDA和GSH评估氧化应激水平，并通过Western blot检测铁死亡标志蛋白和NF-κB通路蛋白表达。
三、研究结果
3.1 乙醛酸盐诱导的肾结石小鼠模型中铁死亡相关变化
研究人员成功建立了乙醛酸盐诱导的小鼠肾结石模型。Von Kossa染色显示模型组肾实质内出现显著的草酸钙晶体沉积；血清生化分析显示模型组血尿素氮和血清肌酐水平升高，提示肾功能受损和肾小管损伤。免疫组化染色显示模型组肾小管区域ACSL4表达升高、GPX4表达降低，同时肾组织MDA水平升高、GSH水平降低，与氧化应激和铁死亡相关改变一致。
3.2 转录组分析鉴定肾结石中候选铁死亡相关基因
批量转录组测序共鉴定出346个差异表达基因，其中319个上调、27个下调。GO富集分析显示这些基因主要与氧化还原酶活性相关，KEGG通路分析显示炎症相关通路包括NF-κB信号通路显著富集。将差异表达基因与FerrDb数据库铁死亡相关基因取交集获得23个重叠基因，通过PPI网络和四种cytoHubba算法鉴定出9个共同候选核心基因：Tlr4、Tlr2、Timp1、Ptgs2、Cd44、Cybb、Lcn2、Lox和Cd74。
3.3 单细胞转录组分析表明Cd74是近端肾小管上皮细胞簇中铁死亡的候选调控因子
对公共单细胞数据集的分析显示，铁死亡模块评分随建模时间点呈进行性增加。在九种枢纽基因中，Lcn2和Cd74在全肾单细胞数据集中随疾病进展表达升高。进一步将分析聚焦于近端肾小管上皮细胞簇后，铁死亡模块评分随建模时间增加而升高，但Lcn2未显示类似的进行性升高，而Cd74在近端肾小管上皮细胞中随时间持续显著升高。这一结果表明Cd74与肾小管上皮细胞在损伤进展中的反应关联更为密切，因此被选为后续功能分析的候选基因。
3.4 CD74调节HK-2细胞中草酸盐诱导的铁死亡相关损伤
Western blot显示草酸盐处理的HK-2细胞中CD74蛋白表达升高，小鼠肾组织免疫组化也显示模型组CD74染色增强。功能实验表明，CD74敲低部分恢复了草酸盐诱导的细胞活力下降，减轻了细胞毒性；而CD74过表达进一步加重细胞损伤。在氧化应激方面，CD74敲低减弱了草酸盐诱导的MDA升高和GSH降低，CD74过表达则加重了这些改变。Western blot显示CD74敲低部分逆转了草酸盐诱导的ACSL4上调和GPX4下调，而CD74过表达进一步增强了这些铁死亡相关标志物的变化。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理可显著恢复细胞活力并降低CD74过表达诱导的MDA升高，为铁死亡作为CD74下游机制提供了支持。
3.5 CD74相关的NF-κB信号参与HK-2细胞中草酸盐诱导的铁死亡
Western blot显示草酸盐处理增加了p65磷酸化水平并降低IκBα表达。CD74敲低减弱了这些变化，而CD74过表达进一步增强了p65磷酸化和IκBα降低。药理学救援实验中，NF-κB通路激活剂TNF-α部分逆转了CD74敲低的保护作用，而NF-κB抑制剂BAY缓解了CD74过表达相关的细胞活力下降。在氧化应激指标和铁死亡标志蛋白方面，TNF-α部分逆转了CD74敲低对GSH、MDA、ACSL4和GPX4的影响，BAY则抵消了CD74过表达诱导的相应改变。
四、讨论与结论
本研究表明CD74在肾结石相关肾损伤中表达上调，并可能参与草酸盐诱导的肾小管上皮细胞铁死亡。机制上，CD74调控与NF-κB信号活性改变相关，NF-κB的药理学干预可部分逆转CD74相关的细胞表型。与既往报道的Sirt1/PGC-1α/NRF2/GPX4轴、ATF4/CHAC1通路和Hippo-YAP1/TEAD1-SLC7A5轴等铁死亡调控通路相比，CD74相关的炎症信号可能代表了连接免疫炎症反应与铁死亡相关肾小管损伤的又一调控层面。CD74作为MIF的功能受体，经典MIF-CD74信号常需CD44作为共受体并可激活下游NF-κB等通路，但本研究未直接评估MIF表达、CD44参与及CD74与NF-κB组分的物理相互作用，该机制仍有待实验验证。NF-κB与铁死亡的关系具有高度情境依赖性，本研究中药理学救援实验的结果需谨慎解读。研究存在样本量较小、单细胞分析基于公共数据且未进行伪批量分析、未进行CD74与近端肾小管标志物共定位验证、上游信号事件未直接研究等局限性。未来需要更大规模的动物队列、肾小管细胞特异性Cd74敲除模型、空间共定位验证和通路特异性机制实验来确认其体内因果关系和细胞特异性。本研究提供了整合的转录组和功能框架，提示CD74/NF-κB信号轴可能作为连接炎症、氧化应激和铁死亡相关肾小管损伤的潜在机制通路，为肾结石相关肾小管损伤提供可能的治疗方向。
结论：本研究提供了证据表明CD74在肾结石相关肾损伤中表达上调，并可能参与草酸盐诱导的肾小管上皮细胞铁死亡。机制上，CD74调控与NF-κB信号活性改变相关，NF-κB的药理学干预可部分逆转CD74相关的细胞表型。这些发现提示CD74/NF-κB轴可能代表肾结石相关肾小管损伤的潜在机制通路和治疗方向。未来需要更大规模的动物队列、肾小管细胞特异性Cd74敲除模型、空间共定位验证和通路特异性机制实验来确认其体内因果关系和细胞特异性。
