Tioxolone-Benzoxonium Chloride Niosomal凝胶增强皮肤利什曼病局部治疗：in silico、in vitro与in vivo评价

《Research and Reports in Tropical Medicine》：Enhanced Topical Treatment of Cutaneous Leishmaniasis Using Niosomal Gel of Tioxolone-Benzoxonium Chloride: In silico, in vitro, and in vivo Evaluation

　　

背景：皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis，CL）是一种被忽视的热带病（neglected tropical disease，NTD），因其现有治疗的毒性和低依从性，对治疗提出了重大挑战。在本研究中，研究人员制备并评价了含有提奥克索隆（tioxolone，NT）、苄索氯铵（benzoxonium chloride，NB）及其组合（NTB）的niosomal凝胶，用于CL的局部应用。

方法：采用包括同源建模和分子对接在内的多种in silico方法评估药理学潜力。针对硕大利什曼原虫（Leishmania major）前鞭毛体和无鞭毛体进行了体外抗利什曼活性测试，同时在BALB/c小鼠模型中评估了体内疗效。

结果：对接研究显示NT、NB和NTB与靶蛋白之间存在强相互作用。ADMET分析表明，NTB具有良好的水溶性（LogS = ?3.71）和低毒性（2.88 mol/kg）。在体外，NTB对两种寄生虫形式均表现出最低的IC₅₀值（前鞭毛体为79.0±3.2 μg/mL，无鞭毛体为44.4±0.8 μg/mL）和最高的选择性指数（selectivity index，SI）（9.8），优于标准药物葡甲胺锑酸盐（meglumine antimoniate，MA）。体内试验显示，与安慰剂、空白niosome和MA相比，NTB显著减小了病变大小和脾脏寄生虫载量（p < 0.05）。

结论：总体而言，这些发现表明NTB制剂具有增强的药理学特性和有效的抗利什曼活性，提示其具有进一步临床研究的潜力。

皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis，CL）是由利什曼原虫属（Leishmania）原虫引起的一种被忽视的热带病（neglected tropical disease，NTD），主要通过雌性白蛉叮咬传播。世界卫生组织数据显示，全球每年新增病例约70万至100万例，99个国家和地区为流行区，超过10亿人面临感染风险。现有治疗方案以五价锑剂如葡甲胺锑酸盐（meglumine antimoniate，MA）为主，但存在需肠外或局部注射、治疗周期长、毒性显著、耐药风险及依从性差等问题。因此，开发有效且安全的局部给药策略成为CL治疗的重要方向。

niosomes（非离子表面活性剂囊泡）因其稳定、生物可降解及可增强皮肤穿透和缓释特性，已被用于CL的局部给药。tioxolone（提奥克索隆，T）与benzoxonium chloride（苄索氯铵，B）具有抗菌和抗炎活性，前期体外研究显示其niosomal剂型对热带利什曼原虫（Leishmania tropica）的抑制活性优于单体形式。基于此，研究人员制备了含T的niosomal凝胶（NT）、含B的niosomal凝胶（NB）及二者联合的niosomal凝胶（NTB），并通过in silico、in vitro和in vivo评价其在硕大利什曼原虫（Leishmania major）感染模型中的抗利什曼活性及免疫调节潜力。

研究人员采用薄膜水化法制备NT、NB和NTB。in silico研究包括从UniProt获取metacaspase-5序列，利用SWISS-MODEL以metacaspase-4（PDB ID：8w8t）为模板进行同源建模，并用MolProbity和Ramachandran图验证模型质量；通过Materials Studio的DMol3模块进行分子量子设计，使用MVD软件将TB、NB、NT、NTB与IL-10（PDB：4x51）、IL-12（PDB：1F45）和metacaspase-5进行分子对接，并用AdmetSAR预测ADMET特性。体外实验以L. major（MRHO/IR/76/ER）前鞭毛体和J774A巨噬细胞内的无鞭毛体为对象，采用MTT法测定IC₅₀。体内实验使用BALB/c小鼠（来源于德黑兰医科大学皮肤病和麻风病研究与培训中心，Center for Research and Training in Skin Diseases and Leprosy, Tehran University of Medical Sciences and Health Services），于后足垫皮下注射2×10⁶个静止期前鞭毛体建立感染模型，4周后分为6组（每组5只），分别给予安慰剂、空白niosome、NT、NB、NTB凝胶（每日两次，共4周）及腹腔注射MA（20 mg/kg/day）。每周测量足垫厚度（D）和宽度（F）以计算病变大小（S=(D+F)/2），第12周处死小鼠，通过有限稀释法测定脾脏寄生虫载量。

**制剂理化表征**：所有niosomal制剂均形成球形单层囊泡，粒径在纳米范围，NTB的包封率超过97%，Span/Tween 60 niosomes表现出最佳物理稳定性和缓释行为。

**同源建模验证**：metacaspase-5模型以metacaspase-4（PDB ID：8w8t）为模板，序列一致性为77.36%。MolProbity评估显示90.4%残基位于最适区域，98.3%位于允许区域，Z-score为?3.36，确认模型质量可靠。

**分子对接研究**：NTB对IL-10、IL-12和metacaspase-5的MolDock分数分别为?174.289、?210.63和?205.29，均优于TB、NB和NT，表明NTB与靶蛋白的结合亲和力最强。NTB通过范德华力、氢键、Pi-烷基等多种相互作用与关键残基结合，提示其兼具免疫调节和直接抗寄生虫作用。

**ADMET与类药性预测**：NTB被预测为HIA?（不吸收）、BBB?（不穿透血脑屏障），且为P-糖蛋白底物；AMES测试显示其无致突变和致癌性，口服毒性低于B和T（LD₅₀=2.88 mol/kg），虽水溶性较低（LogS=?3.71），总体毒性谱更优。

**体外抗利什曼活性**：NT、NB、NTB对L. major前鞭毛体的IC₅₀分别为322.7±10.0、101.8±1.9和79.0±3.2 μg/mL，显著低于MA的673.0±17.3 μg/mL（p<0.001）；对无鞭毛体的IC₅₀分别为83.9±3.1、62.2±3.2和44.4±0.8 μg/mL，亦显著低于MA（103.6±8.5 μg/mL）。NTB的选择性指数（selectivity index，SI）最高（9.8），NB为5.1，MA为6.9，NT为1.6，表明NTB具有更好的选择性毒性。

**体内疗效**：治疗4周后，各治疗组病变大小均显著小于安慰剂组（p<0.001）和空白niosome组（p<0.05）。NTB组平均病变大小为1.2±0.1 mm，显著小于NT（3.1±0.5 mm）、NB（2.9±0.6 mm）和MA（3.3±0.5 mm）（p<0.05）。停药后各组病变有部分增大，但NTB组仍显著小于安慰剂组（p<0.001）。代表性照片显示安慰剂组出现严重溃疡坏死，MA组中度缓解，NTB组几乎完全愈合，残留肿胀极小。

**脾脏寄生虫载量**：治疗开始后8周，NT、NB、NTB和MA组的脾脏寄生虫载量较安慰剂组和空白niosome组显著降低（p<0.001），NTB组与其他药物组及MA组之间差异显著（p<0.05），NTB组寄生虫载量最低。

讨论部分指出，NTB的强效作用可能源于T和B的协同药理活性、niosomal系统促进细胞摄取和局部药物蓄积、以及缓释特性。分子对接结果提示NTB可与IL-10、IL-12和metacaspase-5结合，可能通过抑制IL-10的免疫抑制效应、增强IL-12介导的Th1保护性免疫、并促进感染细胞凋亡来发挥免疫调节作用。此外，B成分可破坏细菌生物膜，有助于控制CL伤口常见的继发性感染，促进愈合。研究局限性包括样本量小（n=5）、未测定实际细胞因子水平、未进行药代动力学和皮肤渗透表征及正式毒性评估。结论认为，NTB在in silico结合亲和力、ADMET特性、体外和体内抗利什曼疗效方面均优于其单一组分和MA，是一种有前景的CL局部治疗候选制剂，值得进一步临床研究。