基于单细胞转录组解析RELB维持成熟牙周膜干细胞成骨潜力的关键作用

《Stem Cell Reports》：Diminished RELB impairs osteogenesis in mature periodontal ligament stem cells

　　

虽然牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）对于牙周组织再生至关重要，但其再生能力随牙周膜（periodontal ligament, PDL）的成熟而下降。为阐明这一现象背后的机制，研究人员对未成熟和成熟的人牙周膜组织进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），以表征异质性并预测影响PDLSCs成骨能力的关键调控因子。随后，通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）在体外和体内实验中对RELB的预测功能进行了验证。scRNA-seq分析揭示了PDLSC群体内显著的异质性。值得注意的是，具有成骨潜能且位于拟时间轨迹末端的PDLSC-5亚型，在成熟牙周膜组织中显著减少。RELB在PDLSC-5中特异性高表达，并被确定为该亚群的关键转录因子（transcription factor, TF）。敲低RELB在体外显著抑制PDLSCs的成骨分化能力，并在体内抑制两个发育阶段的骨形成潜力。这一抑制作用至少部分通过下调其靶基因超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）来介导。研究结果表明，具有成骨能力的PDLSCs比例随组织成熟而显著下降，这解释了成熟牙周组织再生能力降低的原因。此外，RELB被确定为维持PDLSCs成骨潜力的关键转录因子。这些结果为优化PDLSCs骨再生能力策略提供了理论基础。

牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）作为具有自我更新和多向分化潜能的种子细胞，在骨与牙周组织再生中具有重要应用前景。然而，年龄增长和炎症等多种因素可损害其增殖与分化潜能，影响临床疗效的稳定性。牙自体移植利用供牙牙周膜细胞的成骨潜能促进受区骨形成。临床研究表明，牙根未发育完全（开 apex）的牙齿自体移植成功率显著高于根尖闭合牙齿，且骨吸收、根吸收及根尖炎症等并发症发生率更低，提示PDLSCs的增殖和分化潜能可能随组织成熟而下降。鉴于成体干细胞功能随发育阶段动态变化是再生医学领域的核心问题，明确PDLSCs在不同发育阶段的异质性及其调控机制，对优化基于PDLSCs的再生治疗策略具有重要理论价值。基于此，研究人员开展本研究，旨在从单细胞水平揭示不同发育阶段人牙周膜组织的细胞组成差异，并筛选调控PDLSCs成骨能力的关键转录因子（transcription factor, TF）。

研究人员对未成熟组和成熟组人牙周膜组织（每组各20例捐赠者，组织分别混合后使用）进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），通过生物信息学分析解析PDLSCs亚群异质性、拟时间轨迹及转录因子调控网络。随后利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）在体外和体内（非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠皮下移植模型）敲低RELB，验证其在PDLSCs成骨分化中的功能。进一步通过CUT&Tag qPCR验证RELB与靶基因启动子的结合，并通过SOD2过表达回补实验确认调控机制。

主要研究结果如下：

**不同发育阶段PDLSCs增殖与成骨能力差异**：通过流式细胞术确认两组细胞均为间充质来源（CD34?、CD45?、STRO-1?、CD90?、CD105?）。克隆形成实验显示未成熟组集落形成单位-成纤维细胞（colony forming unit-fibroblastic, CFU-F）数量显著高于成熟组；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色和免疫荧光显示未成熟组ALP活性及RUNX2、ALP蛋白表达水平更高，表明未成熟组PDLSCs具有更强的增殖和成骨潜能。

**人牙周膜细胞组成与PDLSCs异质性**：scRNA-seq共捕获未成熟组11,676个细胞和成熟组11,463个细胞，鉴定出6种细胞群体：免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞、PDLSCs、上皮细胞和施万细胞（Schwann cells, ScCs）。组成分析显示成熟组免疫细胞比例显著下降（约50%降至<25%），成纤维细胞、内皮细胞、PDLSCs和上皮细胞比例上升。PDLSCs进一步分为5个亚型（PDLSC-1至PDLSC-5），其中PDLSC-1（MYH11、FRZB、ACTA2）和PDLSC-5（LUM、COL4A1、COL1A1）在成熟组中显著减少，而PDLSC-2、PDLSC-3和PDLSC-4比例增加。拟时间轨迹分析将PDLSC-1和PDLSC-5分别定位于发育连续谱的起点和终点，成骨相关基因（COL1A1、SPARC）仅在末端轨迹簇中表达。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示PDLSC-5特异性基因与创伤愈合、骨化和骨形成密切相关。

**调控PDLSC-5的关键转录因子鉴定**：通过SCENIC分析，BATF、RELB、TWIST1、PRDM1和NFKB2被确定为PDLSC-5中排名前五的转录因子，其中RELB特异性和活性最高。RELB在未成熟组PDL组织中表达显著高于成熟组，且与成骨标志物RUNX2和PDLSC标志物CD105在组织中共定位，未成熟组共定位更明显。RT-qPCR和Western blot进一步证实未成熟组RELB mRNA和蛋白水平均较高。

**RELB调控PDLSCs成骨能力的体内外验证**：siRNA介导的RELB敲低后，未成熟和成熟组PDLSCs的ALP活性和矿化结节形成均减少，RUNX2、ALP和COL-1的mRNA及蛋白表达水平显著下降。体内移植实验中，RELB敲低组新生组织形成减少，残留支架材料增多，新形成组织中的RUNX2表达降低。值得注意的是，敲低后未成熟组PDLSCs的成骨能力仍高于成熟组，提示除RELB外还有其他调控因子参与阶段依赖性成骨。

**RELB通过SOD2调控PDLSCs成骨分化**：在SCENIC识别的RELB靶基因中，SOD2在PDLSC-5中表达差异最为显著。GO富集分析显示SOD2? PDLSCs的差异表达基因与炎症反应、骨重塑、氧化应激、血管生成和骨化相关。RELB敲低显著降低SOD2的mRNA和蛋白水平。基于JASPAR数据库预测并结合CUT&Tag qPCR验证，确认RELB直接结合SOD2启动子上的两个位点。SOD2过表达可部分逆转RELB敲低对成骨的抑制作用，RUNX2、ALP和COL-1表达水平回升。

讨论部分指出，本研究构建了不同发育阶段人牙周膜组织的单细胞转录图谱，揭示了牙周膜成熟过程中细胞组成的动态变化。未成熟组免疫细胞比例较高而成熟组成纤维细胞占主导，这一差异可能源于取样部位、供体特征和聚类标准的不同。尽管成熟组PDLSCs总数增加，但具有成骨潜能的PDLSC-1和PDLSC-5亚型比例显著下降，功能丧失无法通过细胞数量增加来补偿。RELB作为NF-κB转录因子家族成员，其表达水平与PDLSC-5比例及成骨能力正相关。RELB敲低在体内外均抑制PDLSCs成骨，且该效应不依赖于发育阶段，表明RELB是维持PDLSC成骨潜力的通用关键因子。机制上，RELB通过直接结合SOD2启动子调控其转录，SOD2作为抗氧化酶通过清除活性氧促进成骨分化。SOD2过表达可逆转RELB敲低效应，证实RELB-SOD2轴是调控PDLSCs成骨的重要通路。研究结论指出，具有成骨能力的PDLSCs比例随组织成熟显著下降，RELB是维持PDLSCs成骨潜力的关键转录因子，其作用部分通过调控SOD2实现。该研究为理解牙周膜发育的细胞和分子机制提供了基础资源，并为优化基于PDLSCs的再生治疗策略奠定了理论基础。