HOPX调控人干细胞来源的外侧放射状胶质样细胞的发育与谱系进程

《Stem Cell Reports》：HOPX regulates the development and lineage progression of human stem cell-derived outer radial glia-like cells

　　

外侧放射状胶质细胞（outer radial glia, oRG）在人胎儿大脑皮层中含量丰富，但在啮齿动物中罕见，其分子调控机制尚不明确。虽然同源结构域蛋白X（homeodomain-only protein X, HOPX）是公认的oRG标志物，但其在人皮层发育中的功能作用尚未确定。研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在人多能干细胞中敲除HOPX，发现在二维神经培养和三维皮层类器官中，HOPX缺失损害了oRG样细胞的扩增和谱系进程。HOPX敲除的前体细胞增殖减少、神经发生减弱，并向星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系过早分化。HOPX缺陷的类器官表现出外层室下区（outer subventricular zone, oSVZ）缩小、神经元产出减少和早期胶质发生。机制上，HOPX缺失削弱了PI3K-mTOR信号传导。转录组学分析鉴定出HOPX调控的与胶质发生潜能、mTOR和Wnt信号相关的程序。综上所述，这些发现将HOPX确定为oRG样细胞维持和神经-胶质平衡的重要调节因子，为理解人类神经祖细胞扩增的分子程序提供了新见解。

一、研究背景与研究目的

人类大脑皮层的扩张是形成独特智力能力的结构基础。在胚胎发育过程中，位于皮层生发区的放射状胶质细胞（radial glia, RG）通过分裂增殖并最终分化为构成皮层结构的神经元和胶质细胞。随着皮层发育的推进，神经前体细胞（neural precursor, NP）从以神经发生为主的输出转向不断增强的胶质发生潜能，确保皮层神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的顺序产生。与小鼠相比，人类的RG更为丰富且亚型组成更加多样。尤其值得注意的是，人类胎儿皮层中存在一种在小鼠中极为罕见的RG亚型——外侧放射状胶质细胞（outer radial glia, oRG）。解剖学上，oRG位于外层室下区（outer subventricular zone, oSVZ），这是人类特有而小鼠胎儿皮层基本缺失的一个增殖层。定量分析表明，oRG是人类发育中皮层最丰富的神经前体细胞群体，被认为是皮层扩张的细胞基础。非人灵长类的出生标记研究显示，oRG具有广泛的自我更新能力和谱系多样性，能够增加神经元和胶质细胞的产出，从而支撑皮层复杂性。因此，oRG扩增或谱系进程的失调将对人类皮层形成产生广泛而深远的影响。然而，oRG发育的分子调控机制在很大程度上仍然未知。

单细胞RNA测序研究已将同源结构域蛋白X（homeodomain-only protein X, HOPX）鉴定为人oRG的特异性富集标志物。HOPX编码一种非典型的同源结构域蛋白，缺乏内在DNA结合活性，而是通过与转录和染色质调节因子的相互作用来调控多种组织的发育。在小鼠中，Hopx敲除（knockout, KO）主要因心脏缺陷导致早期致死，存活个体的皮层体积和分层组织大致正常，仅在海马等脑区有轻微异常。尽管有研究提示小鼠内侧皮层中罕见的Hopx⁺ oRG样细胞中Hopx破坏会降低增殖，但HOPX在人类皮层发育中的作用，特别是对oRG发育、增殖能力和谱系进程的调控，仍不清楚。

本研究的目的是利用人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）来源的二维（2D）神经培养和三维（3D）皮层类器官，探究HOPX缺失对人类皮层发育的影响。研究人员生成克隆性HOPX KO hPSC系，将其分化为皮层NP，并在支持oRG样祖细胞出现的长期培养条件下维持培养。

二、研究方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在H9 hESC背景下生成HOPX纯合移码突变hPSC系；（2）通过双SMAD抑制法在2D贴壁培养中将hPSC分化为皮层NP，并在含bFGF和胰岛素的增殖培养基中长期扩增以获得oRG样细胞；（3）使用改良方案生成3D皮层类器官，通过抑制SMAD、BMP和WNT通路促进早期背侧前脑模式化并支持oRG样细胞的出现；（4）运用免疫荧光染色、免疫印迹、EdU掺入实验、定量RT-PCR和bulk RNA测序（RNA-seq）等技术进行表型和分子分析。

三、研究结果

1. HOPX KO hPSC和NP的生成

研究发现，在hPSC分化的早期阶段（第30-40天），即神经玫瑰花结形成后不久，vRG样早期NP中检测不到HOPX mRNA或蛋白的表达。而在增殖培养基中长期培养后，第76天开始出现HOPX⁺LIFR⁺ oRG样细胞，且丰度随时间增加。研究人员成功生成HOPX KO hPSC系，并通过免疫染色和免疫印迹确认第90天NP中HOPX蛋白完全消除。

2. HOPX缺失破坏晚期oRG样细胞的扩增

生长曲线追踪显示，HOPX KO NP在早期阶段（第40天）增殖率与对照组相当，但从第90天开始生长显著减慢。免疫染色和EdU掺入实验证实，第90天和第165天的HOPX KO NP中KI67⁺和EdU⁺细胞比例显著降低。免疫印迹显示oRG相关标志物LIFR和PTPRZ1蛋白水平下降。LIFR和SOX2共染结合EdU标记进一步表明，HOPX KO NP中LIFR⁺SOX2⁺ oRG样细胞数量减少且增殖能力降低。在另外两种hPSC系（WIBR1和PGPC17）中使用急性CRISPR介导的基因干扰也得到了一致的结果。

3. HOPX缺失改变晚期oRG样细胞的谱系进程——损害神经发生并促进早熟胶质发生

在不同发育阶段（第40、65、135天）诱导分化后，第40天的HOPX KO NP能正常产生大量TUJ1⁺神经元，但第65天和第135天的KO NP产生的神经元显著减少。在神经元亚型方面，第40天KO NP能正常产生TBR1⁺深层神经元，但第65天和第135天产生的CTIP2⁺和SATB2⁺上层神经元明显减少。同时，晚期KO NP产生了更多的GFAP⁺S100β⁺星形胶质细胞、OLIG2⁺前少突胶质细胞前体细胞（pre-OPC）、SOX10⁺ OPC以及O4⁺未成熟少突胶质细胞。在未分化状态下，HOPX KO NP中GFAP⁺SOX2⁺胶质前体细胞和EGFR⁺SOX2⁺ pre-OPC的比例也显著升高。

4. HOPX缺失破坏皮层类器官中oSVZ的发育和oRG样细胞的扩增

在3D皮层类器官中，HOPX KO类器官在第20、40、60天大小与对照组无异，但从第80天开始显著变小。免疫染色显示，第84天对照类器官含有丰富的HOPX⁺SOX2⁺和PTPRZ1⁺SOX2⁺ oRG样细胞分布于内层室下区（inner SVZ, iSVZ）和oSVZ。定量分析表明，HOPX KO类器官的VZ/iSVZ大小正常，但oSVZ显著缩小，且oSVZ中KI67⁺SOX2⁺增殖前体细胞数量减少。

5. HOPX缺失损害皮层类器官中的神经元分化并促进早熟胶质细胞特化

第84天HOPX KO类器官中TBR1⁺神经元数量正常，但CTIP2⁺和SATB2⁺神经元显著减少。同时，GFAP⁺和S100β⁺星形胶质细胞提前出现，EGFR⁺SOX2⁺ pre-OPC、SOX10⁺ OPC、CNP⁺未成熟少突胶质细胞和MBP⁺成熟少突胶质细胞均显著增多。

6. HOPX缺失损害晚期NP中的PI3K-mTOR信号

免疫印迹分析显示，第90天和第165天的HOPX KO NP中，mTORC1下游靶点4EBP1的磷酸化（Thr37/46）显著降低，而S6的磷酸化（Ser240/244）不变。mTORC2活性指标PKCα（Ser657）和AKT（Ser473）的磷酸化水平也显著降低。

7. RNA-seq分析鉴定晚期NP中HOPX相关的胶质发生程序、Wnt和PI3K-mTOR信号变化

主成分分析（PCA）和层次聚类显示，发育阶段是转录变异的主要来源。差异表达分析鉴定出5,124个差异表达基因（differentially expressed gene, DEG），其中1,382个上调、861个下调。oRG相关标志物如LIFR、PTPRZ1和TNC转录水平降低，而FAM107A和CLU上调。神经发生相关基因整体下调，其中DLK1（非经典NOTCH通路拮抗剂）是最显著下调的基因之一，伴随NOTCH下游效应子HES1、HEY2和NRARP表达升高。星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系程序显著上调。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析显示核糖体和翻译相关基因集下调，Wnt信号通路广泛激活。将NP DEGs与心脏谱系中HOPX结合基因（DamID-seq足迹法鉴定）相交集，发现1,132个重叠基因，包括神经发生程序、胶质发生程序、Wnt信号和PI3K-mTOR负调控因子。跨谱系比较显示一部分HOPX响应性转录变化是保守的，但也存在显著的谱系特异性反应。

四、讨论与结论

本研究的关键意义在于揭示了HOPX不仅维持晚期oRG样细胞的增殖，还协调神经发生与胶质分化的时间控制。从hPSC阶段或在晚期NP中直接进行CRISPR干扰HOPX均导致oRG样细胞增殖显著受损，这与小鼠内侧皮层中Hopx遗传破坏的研究结果一致，支持HOPX在维持oRG样前体细胞增殖能力方面的保守作用。研究结果还揭示了HOPX在保护人类体外皮层发育神经发生阶段中此前未被充分认识的作用。研究人员提出，oRG等基底前体细胞的涌现和丰度增加延长了胎儿皮层发育的神经发生期，延缓向胶质发生的转变，从而增加神经元产出并促进皮层扩张。在hPSC来源的体外皮层系统中，HOPX缺失减少了神经元产生，同时促进了早熟的星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，表明HOPX有助于维持适合持续神经发生的晚期oRG样祖细胞状态，同时抑制胶质发生程序的过早激活。

机制上，HOPX可能部分通过PI3K-mTOR信号通路调节晚期oRG样细胞。人类遗传学研究已确立该通路是皮层生长的关键决定因素，过度激活突变导致巨脑畸形和局灶性皮层发育不良，而低活化突变则与小头畸形相关。在HOPX缺失的情况下，研究人员观察到对应于oRG样NP的晚期发育阶段中4EBP1、AKT和PKCα的磷酸化降低，表明HOPX缺失改变了多个PI3K-mTOR相关信号读数，包括mTORC1和mTORC2关联的输出。RNA-seq结果进一步揭示mTOR信号及其下游翻译和核糖体功能相关基因的表达改变。

观察到的晚期HOPX KO NP中神经发生向胶质发生的过早转变可能反映了多种分子程序的汇聚。转录组数据表明，HOPX缺失既解除了对多个胶质发生能力程序和Wnt信号成分的抑制，又降低了已知在啮齿动物皮层中抑制胶质发生的非经典NOTCH通路拮抗剂DLK1的表达。NOTCH和Wnt信号的共同改变提示HOPX可能通过作为多种促胶质发生信号的上游约束因子来保护神经发生阶段。

总之，本研究利用hPSC来源的模型揭示了物种差异，凸显了人类细胞系统在发现难以在动物模型中研究的机制方面的优势。与Hopx KO小鼠中皮层发育影响有限的报道相反，本研究在HOPX缺失的人类细胞中观察到皮层生长和细胞组成的显著变化，进一步支持了hPSC系统作为研究oRG发育等物种特异性生物学问题的有效平台，并将其定位为研究具有早期发育起源和物种特异性的疾病（包括神经发育障碍、精神疾病和脑癌）的有价值工具。