《Stem Cell Reports》：Quality control and non-clinical testing of iPSC- and ESC-derived medicinal products: A systematic review
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目前，针对胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的细胞药物产品的质量控制（quality control, QC）和非临床检测缺乏专门的指导资源，这导致了检测策略制定过程中的不确定性、可变性和延迟。研究人员采用自定义排名系统，对多种多能干细胞（pluripotent
目前，针对胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的细胞药物产品的质量控制（quality control, QC）和非临床检测缺乏专门的指导资源，这导致了检测策略制定过程中的不确定性、可变性和延迟。研究人员采用自定义排名系统，对多种多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）来源药物产品的检测实践进行了系统评价，并编制了一份全面的"QC菜单"，涵盖相关的关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）、已确立的适用性方法及有前景的技术，以及用于产品开发或临床放行的研究设计。这一整合性资源可为产品开发者和监管机构提供参考，有助于制定信息充分的检测策略，最终提高协调一致性、促进临床转化并确保患者安全。
**一、研究背景与意义**
细胞治疗产品是一类以活细胞和组织为基础的先进治疗药物产品（advanced therapy medicinal products, ATMPs）。近年来，通过胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化制备细胞药物产品的研究与应用日益增多，这两类多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）为药物生产提供了可再生的起始材料来源。PSC来源细胞药物产品首次进入临床应用至今已有16年，近五年启动的临床试验数量显著增长，2024年已超过100项。
药物原料中能够描述和/或影响（试验用）药物产品质量的物理、化学或（微）生物学特性被称为关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）。CQAs需满足相应的质量标准，并通过一系列质量控制（quality control, QC）检测在每批产品放行前进行监测。然而，与传统的化学药物不同，PSC来源细胞治疗产品在CQAs、可接受标准和标准化检测方法方面缺乏详细的可参考资源。尽管针对包括PSCs在内的细胞库检测已有监管指南和共识研讨会建议，但针对PSC来源终末分化产品的检测推荐尚不明确，仅有药典规定的微生物无菌检测、支原体和内毒素检测适用于所有无菌生产药物产品。国际干细胞研究学会（International Society for Stem Cell Research, ISSCR）近期发布的文件提供了更具体的转化路线图，但总体上，PSC来源产品检测策略的制定仍面临重大挑战。
上述挑战主要源于PSC来源产品的创新性、复杂性和多样性。由于靶细胞类型和产品特性的差异，一种产品中行之有效的QC策略往往难以直接转化到另一种产品，需要针对特定产品制定定制化的质量保证措施。监管机构采用基于风险的个案分析方法评估质量检测策略，因此，产品开发者和监管机构都需要全面了解该领域的最新进展，以设计和评估合适的QC和非临床检测策略，从而成功实现产品的临床转化。
**二、研究目的与主要结论**
针对上述问题，研究人员开展了一项系统评价研究，聚焦于终末分化的PSC衍生物，全面梳理了2022至2024年间用于ESC和iPSC来源最终产品的QC和非临床检测实践。研究人员采用自定义排名系统，区分了临床前开发阶段用于产品表征的检测与临床场景中已使用或拟作为QC放行检测的检测方法，系统绘制了PSC来源药物产品的质量检测实践图谱，并开发了一个分级的"QC菜单"，列出经证实和具有前景的、适用于评估各类CQAs的方法。该综合资源可补充现有指南，提供适用技术清单，支持未来检测策略的设计，最终提高PSC来源药物产品质量和患者安全性。
**三、关键技术方法**
研究人员通过系统性文献检索，纳入2022至2024年间发表的50篇研究报告，涵盖多种ESC和iPSC来源产品，其中神经细胞、心肌细胞和间充质基质/干细胞（mesenchymal stromal/stem cells, MSCs）约占总数的二分之一；约半数报告描述了用于临床试验的产品或技术，涉及亚洲（13项临床试验）、美国（3项）和欧洲（1项）。研究人员建立了基于六等级的质量检测排名系统：QC（具有明确可接受标准的临床放行检测）、QCu（无明确可接受标准的临床放行检测）、FIO（仅作参考信息的临床放行检测）、pQC（拟议/潜在的QC检测）、pFIO（拟议/潜在的信息参考检测）和Ch（产品开发过程中的表征检测）。
**四、主要研究结果**
**（一）纳入报告的一般特征**
50篇纳入报告覆盖了多种PSC来源产品，其中神经细胞、心肌细胞和MSCs合计约占半数，另有4篇报告旨在开发适用于多谱系产品的通用技术。
**（二）鉴别（Identity）**
靶细胞鉴别主要通过流式细胞术评估标志物表达，这是最常用的方法，既用于一般表征也用于放行检测。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术和免疫荧光（immunofluorescence, IF）成像分别用于RNA和蛋白表达的定性与定量分析。细胞形态学评估是其次常用的CQA，包括明场显微镜观察、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色和免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色等。代谢参数在胰岛细胞中被提出作为CQA，葡萄糖消耗和乳酸累积速率的变化可反映细胞分化过程中的代谢转换。MSCs的三系分化潜能被用于确证其生理特性而非效力。供体身份确认采用短串联重复（short tandem repeat, STR）分析进行基因型比对。
**（三）杂质（Impurities）**
纯度评估涉及四类杂质：脱靶细胞、致瘤细胞、残留原材料和跨物种污染。脱靶细胞是最常评估的杂质，方法包括流式细胞术、qPCR和IF成像。残留未分化PSCs的检测备受关注，液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的检出限（0.0001%–0.001%）低于qPCR（0.001%–0.38%）和流式细胞术（0.002%–0.2%），高效培养（highly efficient culture, HEC）法也实现了低至0.0005%–0.005%的检出限。体内小鼠和大鼠研究被用于确认无非致瘤性。软琼脂集落形成（soft agar colony formation, SACF）法和细胞生长实验被用于评估细胞的异常增殖和恶性转化风险。残留原材料检测采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MSMS）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）等方法。
**（四）含量（Content）**
细胞活力和总细胞数是最终制剂中最常评估的CQAs，通常采用自动细胞计数器或流式细胞术测量。（共聚焦）荧光显微镜用于评估完整聚集体的活力和膜完整性。外观检查被设定为评估颜色、浑浊度和无外来颗粒的QC标准，pH值在血小板产品中作为放行参数以反映代谢活性和存活率。
**（五）安全性（Safety）**
**基因组完整性：** 11篇报告评估了终产品的基因组完整性。核型分析用于检测染色体的数目和结构异常，比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）芯片和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）芯片用于检测拷贝数变异（copy number variations, CNVs）和拷贝数中性杂合性缺失（copy neutral loss of heterozygosity, CN-LOH）。高通量测序（next-generation sequencing, NGS）方法是使用最频繁的技术，包括靶向测序、全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS，深度约40–83×）和全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES，深度约83–300×），用于检测单碱基突变。后续ddPCR验证被提出用于低频突变的检测，其准确性优于qPCR。
**体外致瘤性检测：** SACF实验、悬浮培养和平板培养实验被用于评估集落形成能力，以Master Cell Bank PSCs和/或中间产品细胞作为对照，癌细胞系或癌细胞掺入样本作为阳性对照。
**体外毒性检测：** 基因工程NK细胞通过与标记的造血祖细胞共培养评估脱靶细胞毒性，工程皮肤组织通过将条件培养基施加于原代角质形成细胞单层并记录细胞凋亡来评估毒性。
**外源病毒检测：** 仅在5篇报告中描述，但均作为QC放行检测应用。方法组合包括：与指示细胞系共培养观察细胞病变效应、血吸附和血凝集试验、qPCR检测已知病毒、定量荧光产物增强逆转录酶（quantitative fluorescent product-enhanced reverse transcriptase, QFPERT）法检测逆转录病毒，以及体内动物研究。
**（六）效力（Potency）**
效力评估方法因产品类型和适应症而异。最常用的方法是测量细胞特异性激素和细胞因子的产生或分泌，包括ELISA、放射免疫测定、质谱、电化学发光和微珠偶联多重免疫测定等。分泌通常在生物相关诱导因子刺激下评估，如离子或葡萄糖刺激、促炎细胞因子处理、缺氧诱导或与肿瘤细胞系共培养。体外细胞实验包括软骨细胞迁移、角质形成细胞划痕实验、淋巴细胞增殖抑制、肌成纤维细胞转分化抑制、CAR-NK细胞抗原特异性细胞毒性及星形胶质细胞促进轴突生长等功能评估。此外，形态学变化、分化能力、电生理分析、血小板PAC-1结合和聚集、MSC迁移以及心肌细胞片的机械强度等也被用作效力相关CQA。
**（七）稳定性（Stability）**
稳定性研究主要评估细胞活力、标志物表达和形态的变化，覆盖了延长培养、室温保存期间的在用稳定性、配方溶液中的储存、运输以及冷冻保存等方面。基因组稳定性通过核型分析或SNP芯片评估。冷冻保存后最长检测时间点报告为6个月和36个月，并计划延长至60个月。递送装置的影响在挤出后立即监测，并在猪体内研究中观察至移植后11个月。
**（八）非临床体内研究**
小鼠和大鼠是最常用的动物种属，非人灵长类和兔是大动物模型的主要选择，猪用于特定产品如心肌细胞片的疗效评估。安全性研究多在免疫缺陷小鼠品系中进行，疗效评估主要在遗传、机械或药物/毒素诱导的疾病模型中进行。大多数研究评估了单剂量给药，剂量递增（2–5个不同细胞数量）主要用于寻找治疗有效或无毒剂量。阴性对照组多为未处理、假手术或给予载体（生理盐水、培养基或缓冲液）。细胞产品主要经临床预期途径给药。良好实验室实践（Good Laboratory Practice, GLP）条件在生物分布和毒性研究中最常应用（4/10），其次为致瘤性研究（6/20），疗效研究很少在GLP条件下进行（1/23）。值得注意的是，部分体内致瘤性实验被纳入QC放行检测，包括将产品移植到10只或50只免疫缺陷小鼠中并观察16周或4个月的肿瘤形成情况。
**（九）非临床研究与质量检测的典型特征**
典型的非临床安全性和有效性研究描绘了一种模式：近一百只免疫抑制啮齿动物，具有均衡的雌雄比例，比较单剂量细胞产品与阴性对照的效果，通过临床相关途径给药，中位随访5–10个月。QC放行检测方法在通用性和应用频率上呈现从通用到产品特异性的谱系分布，系统提取的CQAs和检测方法已汇编为全面的资源。
**五、讨论与结论**
本综述将质量检测方法按照自定义排名系统进行了分级，QC和QCu级别的技术汇总形成了"QC菜单"，为产品开发者提供了新的QC检测小组设计的参考蓝图。然而，病毒安全性和基因组完整性评估的检出频率低于预期，可能源于产品开发中的过程控制、上游QC检测或未公开的检测结果。测试面板报告碎片化问题突出，标准化的完整报告有助于提高研究可比性，加速产品开发和监管审评。pQC级别的技术代表正在验证中的前沿方法，NGS有望在病毒检测中发挥更大作用，但需建立标准化的最低技术要求（如测序深度）。此外，拉曼成像、多功能微电极阵列、原子力显微镜和人工智能（artificial intelligence, AI）辅助的形态学分析等新兴方法展现出良好的应用前景。
本研究的结论是：该综述创建了PSC来源产品近期QC和非临床检测实践的综合资源。自定义排名系统揭示了最先进的和已确立的适用性检测方法，为产品开发者和监管机构提供了制定未来QC策略的工具包。该综述同时强调了通用方法和产品特异性解决方案，识别了现有差距，并指出了协调统一、透明报告和持续创新的必要性，以确保PSC来源疗法安全有效的临床转化。
