可变剪接与组蛋白泛素化串扰调控快速化学重编程至多能性

《Stem Cell Reports》：The crosstalk between alternative splicing and histone ubiquitination modulates fast chemical reprogramming to pluripotency

　　

细胞重编程已经彻底改变了再生医学。近年来，研究人员开发了一种快速化学重编程（fast chemical reprogramming, FCR）系统；然而，其潜在的分子机制在很大程度上仍然未知。在此，研究人员研究了FCR系统中RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）表达和可变剪接（alternative splicing, AS）事件的动态变化。研究人员发现，敲低AS调节因子PTBP3可显著提高FCR效率。机制上，研究人员确定PTBP3-SCMH1轴调节了包括炎症通路在内的多个下游通路。使用Amlexanox和BMS-345541对炎症通路进行药理学抑制可进一步提高FCR效率。总之，这些结果强调了AS在FCR中的关键作用，并表明由PTBP3-SCMH1轴介导的AS与组蛋白泛素化之间的串扰可用于调节细胞命运。这些研究将有助于更好地理解仅凭小分子如何快速诱导多能性这一迷人问题，并为再生和年轻化提供新方法。

**论文解读：可变剪接与组蛋白泛素化串扰调控快速化学重编程**

体细胞重编程为多能性可通过核移植、转录因子或小分子实现，所得的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）在分子和功能上类似于囊胚来源的胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）。近年来，研究人员开发了快速化学重编程（fast chemical reprogramming, FCR）系统，可在7–12天内无需遗传操作产生iPSCs，在干细胞生物学和再生医学中具有巨大潜力。然而，小分子单独如何将体细胞重编程为多能性仍是一个重要而未解答的问题。化学重编程中的转录后调控仍知之甚少。可变剪接（alternative splicing, AS）是转录后调控的主要形式之一，在协调细胞多样性中发挥关键作用。PTBP家族是重要的RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP），可调节剪接、mRNA稳定性和翻译，但PTBP3在化学重编程中的功能尚不清楚。多梳蛋白SCMH1是polycomb repressive complex 1（PRC1）家族成员，催化H2AK119ub以沉默基因表达，但其上游调控因子仍不明确。因此，本研究以FCR为细胞命运转变的代表模型，系统研究了RBP表达和AS动态，旨在鉴定关键调控因子并揭示其分子机制。

研究人员首先通过比较小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）、FCR诱导的iPSCs（fiPSCs）和小鼠ESCs（mESCs）的转录组数据，发现FCR能成功重塑RBP表达和AS景观。随后，利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）轨迹分析及shRNA功能筛选，鉴定出PTBP3为FCR的负调控因子。机制研究中，研究人员整合bulk RNA-seq、scRNA-seq、CUT&Tag、RNA免疫沉淀（RIP-qPCR）及反义寡核苷酸（ASO）等手段，确定了PTBP3的下游靶点包括Scmh1和Socs7，并证明PTBP3-SCMH1轴通过调节炎症基因上的H2AK119ub沉积来调控重编程。药理学抑制炎症通路可进一步提高FCR效率。这些发现揭示了AS与组蛋白泛素化之间的串扰，为调控细胞命运提供了新策略。

在技术方法方面，研究人员利用先前建立的FCR体系，以OG2小鼠与129小鼠交配胚胎分离的MEFs及成年小鼠肺成纤维细胞（MLFs）为样本。主要技术包括：bulk RNA-seq和10× Genomics scRNA-seq用于分析RBP表达与剪接动态；shRNA文库筛选用于功能验证；CUT&Tag用于全基因组H2AK119ub图谱分析；RIP-qPCR验证PTBP3与Scmh1 RNA结合；ASO和minigene报告实验验证PTBP3对Scmh1剪接的直接调控；CUT&Tag-qPCR评估H2AK119ub和H3K27me3富集。生信分析使用vast-tools、SCENIC、DESeq2等工具。

**研究结果**：

**小分子成功重塑从体细胞到多能状态的RBP表达和AS模式。** 通过比较MEFs、fiPSCs和mESCs的bulk RNA-seq数据，主成分分析显示RBP表达模式从MEFs向mESCs转变；KEGG分析富集到剪接体通路；PSI聚类显示fiPSCs和mESCs剪接模式相似，而与MEFs不同。Cep85和Kifc3等基因的剪接形式在重编程后发生改变，且跳过外显子及其侧翼内含子长度呈现特征性变化，表明FCR成功实现了RBP介导的AS景观重编程。

**PTBP3作为FCR的负调控因子。** 基于scRNA-seq成功重编程轨迹，筛选表达动态变化的剪接相关RBP，shRNA敲低Ptbp3使fiPSC克隆数增加2倍，并上调多能基因Oct4和Dppa5a；Ptbp3过表达抑制克隆形成和全能基因诱导。其他PTBP家族成员无此效应。在MLFs中敲低Ptbp3同样促进FCR，但在转录因子诱导重编程中无显著作用。此外，小分子616452通过SMAD2负调控Ptbp3表达。

**Ptbp3敲低后的深度RNA-seq分析。** 对第8天细胞进行RNA-seq，鉴定出421个上调和630个下调蛋白编码基因；GO分析显示下调通路包括炎症反应调控。与PTBP3 CLIP数据整合发现319个直接靶标。长链非编码RNA和转座子表达也发生改变，如Rian上调、MMVL30-int下调，提示Ptbp3敲低可能影响iPSC质量和逆转座子调控。

**Ptbp3敲低后的scRNA-seq分析。** 第12天样本scRNA-seq显示，shPtbp3组中中间态和新生iPS细胞比例更高，Oct4和Dppa5a阳性细胞比例增加；SCENIC分析显示多能性相关调节子活性增强。基因表达变异度略有降低，细胞进入更稳定状态。KEGG分析显示上调代谢、生物合成、自噬等通路，下调炎症、抗原加工呈递等通路。

**PTBP3在FCR中的功能性下游靶点。** 分析剪接事件变化，鉴定出约200个Alt5、200个Alt3、600个CEx和800个IR事件；CEx事件中富集PTBP3结合基序，且与CLIP数据交叉得到93个直接结合靶标。功能筛选发现敲低Scmh1或Socs7显著降低FCR效率；验证了Socs7和Scmh1的剪接变化，PTBP3可能直接结合其外显子侧翼序列调控剪接。

**PTBP3-SCMH1轴在FCR中发挥作用。** SCMH1是PRC1亚基，敲低Scmh1抑制FCR，且与shPtbp3联合实验表明SCMH1部分介导PTBP3功能；过表达长亚型SCMH1(L)促进重编程，短亚型SCMH1(S)抑制；缺失geminin结合域的SCMH1无效。ASO靶向PTBP3结合位点提高Scmh1(L)比例并增强FCR；minigene实验证明PTBP3直接调控Scmh1剪接。CUT&Tag分析H2AK119ub动态，发现低甲基化簇富集炎症相关通路。

**PTBP3-SCMH1轴通过H2AK119ub修饰调控炎症通路。** Ptbp3敲低后CUT&Tag显示H2AK119ub在炎症基因Oasl2、Eif2ak2、Bst2和间质基因Twist1启动子处信号增强，基因表达下调；Scmh1敲低则相反。过表达SCMH1(L)而非SCMH1(S)可恢复H2AK119ub水平。敲低Bst2、Eif2ak2、Oasl2或使用TBK1抑制剂Amlexanox和IKK抑制剂BMS-345541均能提高FCR效率，且这些抑制剂至少部分作用于PTBP3下游。

**讨论与结论。** 讨论部分总结了AS与H2AK119ub串扰在FCR中的关键作用，指出Scmh1长短异构体的平衡提供了精确调控细胞命运的机制。Rian上调提示瞬时空扰PTBP3可能改善fiPSC质量。局限性包括scRNA-seq生物学重复不足、仅测试一个ASO以及慢病毒载体可能引发先天免疫反应。研究结论可概括为：研究人员研究了仅由小分子诱导的多能重编程过程中的转录后调控景观，揭示了PTBP3-SCMH1轴如何连接AS与组蛋白泛素化，从而影响表观遗传和转录调控。AS在调控快速化学重编程至多能性中发挥关键作用，这些发现有助于理解小分子诱导多能性的机制，并为再生和年轻化提供新途径。