《Food Bioscience》：Rational engineering of a nucleotide-promiscuous glycosyltransferase for enhanced gastrodin biosynthesis
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•工程化GT1家族糖基转移酶itUGT2扩展了NDPG供体多样性。•M25突变体以TDPG为底物时的催化效率提高了4.98倍。•M25突变体以TDPG为底物时实现了与野生型以UDPG为底物相当的活性。•M25突变体实现了高效的天麻素合成，产率达到5.82 g/L，提高了81.
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工程化GT1家族糖基转移酶itUGT2扩展了NDPG供体多样性。
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M25突变体以TDPG为底物时的催化效率提高了4.98倍。
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M25突变体以TDPG为底物时实现了与野生型以UDPG为底物相当的活性。
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M25突变体实现了高效的天麻素合成，产率达到5.82 g/L，提高了81.31%。
引言
糖苷是具有重要商业价值的生物活性天然产物，广泛应用于制药、食品和化妆品行业。其传统生产依赖于植物提取或化学合成，但这两种方法都存在固有局限。植物提取受限于野生资源的枯竭、生长周期长以及对区域气候变化的敏感性。化学合成则面临多步反应复杂性、立体选择性差、过度依赖有机溶剂以及显著的环境影响等问题。在此背景下，微生物催化和合成生物学作为一种有吸引力的替代方案应运而生，能够在温和条件下实现糖苷合成，同时在可持续性、可扩展性和环境兼容性方面具有明显优势。然而，胞内糖苷供体的可用性不足以及底物成本过高仍然在实际应用中制约着其发展。因此，建立充足且高效的糖苷供体供应体系是糖苷生物合成中最主要的瓶颈之一。
天麻素（4-羟基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）是一种具有神经保护、镇静和抗惊厥活性的酚糖苷，广泛应用于临床治疗头痛、眩晕、癫痫和神经退行性疾病。受日益增长的医疗需求驱动，近年来的研究越来越关注构建天麻素生产的微生物细胞工厂。代表性策略在大肠杆菌、酿酒酵母或Lipomyces中重构莽草酸途径以支持p-对羟基苯甲酸（pHBA）的原位生物合成，然后引入异源UDP-糖基转移酶，如拟南芥的AtUGT、长春花属的AsUGT、红景天的RrUGT3和番茄的SlyUGT，催化从UDPG到pHBA的葡萄糖基转移，最终生成天麻素。作为这一生物合成途径的核心催化剂，糖基转移酶直接决定了整体产物的生成。然而，大多数天然糖基转移酶表现出严格的底物特异性，几乎完全依赖UDPG作为唯一的糖苷供体。
提高胞内UDPG可用性的代谢工程努力主要集中于通过过表达磷酸葡萄糖变位酶和UDPG焦磷酸化酶来强化UDPG生物合成途径。尽管采取了这些措施，胞内UDPG浓度通常仍不足以维持高速糖基化反应。虽然外源补充UDPG提供了潜在的解决方案，但其高昂的成本破坏了微生物合成的经济可行性，同时损害了原子经济性和过程可持续性。
另一种策略是利用并工程化糖基转移酶（GTs）的底物多样性，拓宽其接受非天然糖苷供体的能力。然而，该领域的研究主要集中在GT多样性的两个维度：苷元特异性和糖基特异性。扩展苷元特异性可以拓宽GT识别的非天然受体范围，从而多样化可生产糖苷的结构谱；而工程改造糖基特异性则可实现半乳糖、木糖和鼠李糖等替代糖的转移，用于组装稀有糖苷衍生物。然而，核苷酸供体多样性却远未受到足够关注。目前知识仅限于某些GT可接受非UDPG供体的零星报道，核苷酸识别机制尚未得到充分理解，系统的理性工程方法更是完全缺失。此外，GT对非UDPG供体的催化活性始终报告比UDPG低一到两个数量级，远低于工业过程对反应速率和选择性的要求。这一点尤其重要，因为微生物细胞自然产生多种替代核苷酸糖，包括TDPG、鸟苷二磷酸葡萄糖（GDPG）、腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和胞苷二磷酸葡萄糖（CDPG），这些糖由于天然GT固有的严格核苷酸供体特异性而完全未被用于糖苷生物合成。
作为自然界最大的糖基转移酶家族，GT1酶是植物次级代谢物糖基化的核心，使其成为兼具实际应用价值和科学意义的研究对象。所有GT1成员共享一个标志性结构基序——PSPG（Plant Secondary Product Glycosyltransferase）盒，该盒负责选择性识别UDP-糖供体的核苷酸部分。这种深度的结构保守性使GT1酶锁定在严格的UDP-糖特异性上，使得通过随机诱变实现供体底物多样化几乎不可能。因此，对核苷酸结合口袋的定向理性重新设计是一个更有希望的途径，能够在不牺牲结构完整性的前提下精确调节核苷酸识别多样性，同时揭示支撑供体选择性的复杂序列-结构-功能关系。克服这种严格的UDP-糖依赖性具有基础和生物技术双重意义：由此产生的酶学工具能够动员胞内多种NDPG物质，开辟全新的不依赖UDPG的糖苷生物合成途径。
基于这些目标，本研究工程改造了一种核苷酸多样性糖基转移酶以提高天麻素产量。所选支架itUGT2（GenBank: BBB16128.1）是来自木蓝的GT1家族酶，具有已确认的天麻素合成活性，其完整编码序列已存入支持信息。通过整合GT1家族序列保守性分析与分子对接，我们系统地绘制了控制核苷酸部分识别的残基图谱，并表征了其结合相互作用，然后应用理性设计重塑核苷酸结合口袋。所得变体M25对非天然供体TDPG的催化效率（kcat/Km）显著提升，最终匹配了野生型酶对其天然底物UDPG的效率。分子动力学模拟证实了这些增益，揭示了与野生型相比，M25具有更强的酶-底物相互作用和更高的构象稳定性。应用于全细胞天麻素生物合成时，表达M25的工程菌株在摇瓶培养中达到了5.82 g/L的发酵浓度。总体而言，本研究确立了核苷酸结合口袋理性工程化作为扩展GT1供体多样性的有效策略，展示了利用内源NDPG多样性进行糖苷生物制造的新范式，并为在工业生物催化应用中部署GT1酶提供了可复制的技术基础。
章节摘要
菌株、质粒和试剂
大肠杆菌菌株BL21(DE3)和DH5α分别用于蛋白质过表达和天麻素生产，以及质粒扩增和基因克隆。质粒pRSFDuet-1保存在我们实验室，所有野生型和突变型itUGT2蛋白均使用pRSFDuet-1载体表达。天麻素、pHBA、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖（IPTG）和4-甲基伞形酮（4-MU）购自天津市海恩斯OPDE技术有限公司。UDPG由上海源叶生物提供。
itUGT2的核苷酸供体多样性
通过测定纯化酶对五种NDPG供体（UDPG、TDPG、CDPG、GDPG和ADPG）与pHBA作为糖苷受体时的活性，表征了itUGT2的核苷酸多样性。反应在200 μL含100 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）、2 mmol/L供体、1 mmol/L pHBA和10 μg itUGT2中进行，37 °C孵育5小时。itUGT2对UDPG活性最高，pHBA转化率约为90.89%（表1）。对TDPG和CDPG的活性大幅下降。
结论
如本研究所针对的GT1家族糖基转移酶itUGT2所示，对核苷酸结合口袋的理性工程改造是一种可行且有效的策略，可系统地扩展核苷酸供体多样性。突变体M25对非天然供体TDPG的催化效率与野生型酶对其天然供体UDPG的性能完全相当。分子动力学模拟将这种性能提升归因于结构稳定性增强和更紧密的结合。
作者贡献声明
崔彩霞：写作-审阅与编辑、监督、项目管理。张召：数据整理。王子文：数据整理。沙鑫：数据整理。乔国豪：数据整理。明宏：数据整理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本论文所报告的工作。
声明
所有作者同意将我们新颖且原创的工作投稿至《Food Bioscience》期刊。本文尚未公开发表，在收到决定前也不会提交至其他地方。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本论文所报告的工作。
致谢
本研究得到了河南医学院科研基金（XYBSKYZZ201717）、河南省自然科学基金（252300420804）、西藏自治区自然科学基金（XZ202601ZR0067）的支持。所有作者确认他们与本手稿描述的工作没有利益冲突。
Caixia Cui|Zhao Zhang|Zhiwen Wang|Xin Sha|Guohao Qiao|Hong Ming
