通过发育模式化引导人诱导多能干细胞生成GABA能神经元身份

《Stem Cell Reports》：Directing GABAergic neuronal identity from human iPSCs through developmental patterning

　　

中文摘要翻译： GABA能中间神经元与多种神经发育和神经精神疾病密切相关。转录因子（TF）介导的人多能干细胞（PSCs）诱导可快速生成GABA能神经元，但其区域身份仍缺乏明确界定。本研究表明，起始细胞群的染色质状态限制了ASCL1和DLX2所指定的神经元身份。在TF诱导之前，通过双SMAD和WNT抑制进行短暂神经模式化，可使PSCs偏向生成具有前脑相关身份的GABA能神经元；而直接对PSCs进行TF诱导则产生具有更广泛区域特征的神经元，包括下丘脑和丘脑程序。研究人员将多种方法与人胎脑图谱进行基准比对，揭示了不同方法间 distinct 的区域身份偏向和疾病基因富集特征，为疾病建模选择分化策略提供了框架。将该方法应用于ADNP综合征，研究人员证明复发性p.Tyr719?突变破坏了中间神经元成熟和亚型相关转录程序，并损害了人GABA能神经元中的抑制性突触传递。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

GABA能（γ-氨基丁酸能）中间神经元是神经环路组织中的关键抑制性细胞类型，其发育起源涵盖端脑腹侧的多个祖细胞区域，包括内侧神经节隆起（MGE）、尾侧神经节隆起（CGE）和外侧神经节隆起（LGE）。这些区域来源的中间神经元亚群具有不同的分子和功能特性，并与自闭症谱系障碍（ASD）、癫痫、精神分裂症和阿尔茨海默病等多种疾病密切相关。尽管人多能干细胞（PSCs）来源的GABA能神经元已在疾病机制研究中得到广泛应用，但现有分化策略存在明显局限：传统小分子模式化方法虽能模拟MGE发育，但成熟周期长、CGE/LGE代表性有限、不同PSC系间效率差异大；而基于转录因子（TF）直接重编程的方法虽快速可重复，但所生成神经元的区域身份、细胞组成和异质性在单细胞分辨率下仍不明确。此外，起始细胞群的染色质状态如何影响TF介导的命运决定，其机制基础尚未阐明。本研究旨在通过将短暂发育模式化与TF诱导相结合，系统性地解决上述问题。

二、研究内容与主要结论

研究人员将双SMAD和WNT抑制介导的短暂神经模式化与ASCL1和DLX2的可诱导表达相结合，开发了一种快速且可重复的GABA能神经元生成方法。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和联合染色质可及性分析，研究人员发现起始细胞群的染色质状态限制了ASCL1和DLX2所能指定的神经元身份：模式化祖细胞生成具有皮层和神经节隆起相关分子特征的GABA能神经元，而未经模式化的PSCs则产生混合区域身份神经元，包括下丘脑和丘脑特征。研究人员进一步将TF诱导方法与传统小分子方案进行系统比较，并以人胎脑图谱为基准，揭示了不同方法间 distinct 的区域身份偏向和疾病基因富集特征。在功能验证方面，模式化诱导GABA能神经元（iGABAs）在体外表现出成熟的电生理特性和抑制性突触传递，移植到新生小鼠脑内后能够存活、成熟并整合入神经环路。最后，研究人员将该框架应用于ADNP综合征的疾病建模，证明复发性p.Tyr719^?突变损害了人GABA能神经元的中间神经元成熟、亚型相关转录程序及抑制性突触传递。

三、关键技术方法

本研究采用了以下主要技术方法：基于PiggyBac转座子系统建立稳定可诱导ASCL1-DLX2表达的iPSC系；利用双SMAD抑制（SB431542、LDN193189）和WNT抑制（XAV939）进行短暂神经模式化；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对12,876个细胞进行转录组分析；采用SHARE-seq技术同时检测单细胞染色质可及性和基因表达；使用SCENIC进行基因调控网络推断；通过电生理膜片钳记录评估神经元功能；将模式化iNs移植入Rag2^?/?新生小鼠脑内进行体内功能验证；利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ADNP p.Tyr719^?突变iPSC系。样本来源包括PGP1和WTC11两株人iPSC系及一株女性对照系CC1599.101A。

四、研究结果

1. 1.
   ASCL1和DLX2从模式化祖细胞诱导GABA能神经元：研究人员对三种分化策略生成的细胞进行scRNA-seq分析，发现模式化iNs中SLC32A1表达显著高于3天诱导组，且7天TF诱导促进更成熟的神经元和GABA能分化状态，表明TF诱导时长和外在模式化线索共同塑造诱导GABA能神经元培养物的分化状态和细胞组成。
2. 2.
   不同分化策略生成分子多样的GABA能神经元：对SLC32A1⁺神经元进行无监督聚类，鉴定出五个主要分子簇。7D-模式化iGABAs富集NR2F2、PAX6和ISL1等CGE/LGE相关标记，而PSC-iGABAs富集FOXA2和NKX2-2等下丘脑相关标记。基于人胎脑参考图谱的区域映射显示，模式化条件下GE和皮层相关群体富集，而PSC-iGABAs优先映射至下丘脑和丘脑身份。跨三个独立iPSC系的参考映射高度一致，表明结果可重复。
3. 3.
   模式化GABA能iNs的功能特性和突触整合：电生理记录显示模式化iNs具有内向钠电流、重复动作电位发放和自发抑制性突触后电流（sIPSCs），且sIPSCs可被印防己毒素阻断，确认GABA能突触传递。免疫染色证实DLX2、DLX5、SST、CB和CR等标记的表达在多个iPSC系和独立分化间可重复。移植到新生小鼠脑内五个月后，人神经元表现出活跃的电生理特性，接收宿主皮层环路的兴奋性和抑制性突触输入，并形成突触前特化结构。
4. 4.
   神经精神和神经疾病基因在不同GABA能iN类型中的富集：基因集富集分析显示，PSC-和模式化iGABAs共享基因富集多种脑疾病风险基因，但模式化iN特异性基因显著富集ASD风险基因（SFARI数据库，优势比=2.50），且与AD和ASD患者死后脑组织的疾病相关中间神经元特征重叠，表明模式化iNs在神经系统疾病建模方面具有优势。
5. 5.
   不同GABA能诱导神经元背后的基因调控网络：SCENIC分析揭示PSC-iGABAs富集FOXA1、FOXA2、PBX1等下丘脑区域化相关调控子，而模式化iGABAs富集NR2F1/2、DLX6、PAX6等神经命运决定和迁移相关调控子。模式化iNs表现出更均一的调控程序，表明分化策略通过 distinct 的基因调控网络塑造GABA能神经元身份。
6. 6.
   ASCL1和DLX2在PSCs和模式化祖细胞中诱导 distinct 的谱系特异性基因调控网络：SHARE-seq分析显示，模式化细胞呈现中间神经祖细胞样状态，ASCL1/DLX2诱导后更受约束地转向GABA能身份；而PSCs保留更广泛的调控可塑性，可激活额外TF程序。模式化祖细胞经历更多谱系受限的染色质重塑，而PSCs在早期分化中表现出更广泛的调控可塑性。
7. 7.
   模式化iGABAs的疾病建模潜力：利用CRISPR-Cas9在PGP1和WTC11两株iPSC系中引入ADNP p.Tyr719^?突变，并通过内源HA标签证实截短蛋白的稳定表达。scRNA-seq分析显示突变神经元中CGE来源中间神经元标记（NR2F2、PROX1）和LGE来源标记（FOXP2、CALB1）显著下调，而RELN上调。电生理记录显示突变神经元sIPSC和mIPSC频率显著降低，而幅度不变，表明突触前抑制性传递受损。

五、讨论与结论

本研究表明，TF诱导和模式化iNs代表了具有 distinct 区域和发育特性的互补神经元模型。TF-only PSC-iGABAs适用于追求速度、可扩展性和广泛抑制性神经元生成的场景，而模式化iGABAs更适合需要前脑/神经节隆起相关分子程序或疾病相关皮层中间神经元特征的研究。研究证实分子异质性是可重复的而非随机的，跨iPSC系和独立分化的一致性验证了系统的可靠性。在ADNP综合征建模中，p.Tyr719^?突变导致的抑制性突触传递频率降低提示中间神经元自主的突触前机制，且杂合子和纯合子突变神经元高度相似的转录谱表明截短蛋白可能干扰全长ADNP功能而非单纯基因剂量效应。总体而言，模式化iGABAs应被视为分子模式化的人GABA能神经元，而非完全成熟的中间神经元亚型等价物，该系统为解析多种神经发育和神经精神疾病的分子机制提供了灵活平台。