基于轮状PtCuMn、核壳结构Pd@Pt和DNA风车结构的电化学适配体传感器用于同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A

《Food Bioscience》：Electrochemical Aptasensor Based on Wheel-shaped PtCuMn, Core-shell Pd@Pt, and DNA Windmill Structure for Simultaneous Detection of Aflatoxin B 1 and Ochratoxin A

　　

摘要：为解决食物中黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）快速、高灵敏度同时检测的迫切需求，本研究基于轮状PtCuMn纳米结构、核壳Pd@Pt纳米晶体和DNA风车结构构建了一种电化学适配体传感器。与无结构对照相比，DNA风车结构使AFB1通道的蒽醌（AQ）信号增强了2.02倍，OTA通道的硫靛（Thi）信号增强了2.41倍，表明DNA风车结构能够在单个识别单元上组装多个信号探针，显著提高了识别效率。轮状PtCuMn具有大的比表面积、高导电性和优异的电催化活性，增强了探针负载能力和电子转移效率，PtCuMn/AuE上AQ信号为AuE上的1.88倍。核壳Pd@Pt纳米晶体暴露Pt原子作为表面活性位点，提高了电催化活性并确保了信号稳定性，Pd@Pt/AuE上Thi信号为AuE上的1.74倍。实验结果表明，传感器对AFB1和OTA的检出限分别低至0.169 pg/mL和0.0285 pg/mL，线性范围宽广（0.005 ng/mL至500 ng/mL）。传感器表现出优异的选择性、重复性、重现性和稳定性。其在豆粉和食用油等真实样品中的良好表现证实了其在复杂基质中的应用潜力，且对包括玉米粉和小麦粉在内的质量控制样品的检测结果与高效液相色谱（HPLC）法获得的结果相当。

引言：霉菌毒素是由曲霉属和青霉属等丝状真菌产生的次级代谢产物。它们广泛污染农产品和饲料，包括谷物、坚果和食用油，对人类健康和牲畜生产构成严重威胁[1]。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）因其高毒性、广泛污染和协同毒性效应而受到全球关注[2]、[3]、[4]。这两种霉菌毒素经常在同一农产品中共存，其联合暴露可能导致相加或协同毒性[5]、[6]、[7]。因此，开发快速、灵敏的分析方法来同时检测AFB1和OTA对于确保食品安全和保护公众健康具有关键的实际意义。

目前，霉菌毒素的检测主要依赖于高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等仪器方法[8]。虽然这些方法准确可靠，但通常需要复杂的样品前处理、昂贵的设备和高水平操作人员，不适合快速现场筛查[9]、[10]。免疫分析法，特别是酶联免疫吸附测定（ELISA），已广泛应用于单一毒素的检测。然而，它们在多目标同时检测方面面临挑战，包括抗体交叉反应性、有限的标记策略和繁琐的程序[11]、[12]。与抗体相比，适配体具有稳定性好、易于合成和修饰、靶标范围广以及易于构建多重检测系统等独特优势[13]、[14]、[15]、[16]。近年来，通过指数富集配体系统进化（SELEX）鉴定和优化了高亲和力适配体，提供了可靠的识别元件[17]、[18]。所选适配体已被用于构建各种高性能传感平台[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]，在食品安全、环境监测和临床诊断等领域展现出巨大的应用潜力[26]、[27]。其中，基于适配体的电化学传感器结合了适配体的高特异性与电化学检测的优势，包括高灵敏度、快速响应、仪器便携性和低成本，使其成为食品安全检测领域的前沿方向。在此基础上，基于适配体的传感器已被广泛应用于AFB1和OTA等霉菌毒素的检测[28]、[29]、[30]、[31]。

实现多种霉菌毒素同时检测的挑战在于在单个传感界面上构建互不干扰的信号转导通路，并在结合不同靶标时产生可区分的电化学响应。近年来，纳米材料与DNA纳米结构的结合为这一挑战提供了创新解决方案[32]。具有特定形貌和组成的纳米材料可以大大提高传感界面的电子转移效率和生物分子负载能力[33]。例如，Li等人利用核壳纳米结构作为基底，结合探针分子实现了超灵敏检测[34]。Wang等人通过激光烧蚀制备了无表面活性剂铂纳米球，表现出增强的电催化活性[35]。Niu等人构建了基于二维共价有机框架的生物传感器，用于高灵敏度检测AFB1[36]。这些策略突出了功能纳米材料与DNA纳米结构相结合在实现信号放大和稳定传感方面的巨大潜力。因此，空心纳米结构，特别是三元PtCuMn轮状纳米材料，由于其高的比表面积、丰富的活性位点和优异的电催化活性，在电化学传感方面展现出巨大潜力[37]、[38]、[39]、[40]。其轮状结构促进了传质，而Pt、Cu和Mn之间的协同效应进一步提高了电催化性能[41]、[42]，使其成为构建高灵敏度传感平台的理想材料。得益于核壳纳米结构，所制备的Pd@Pt纳米晶体表现出优异的稳定性及高电催化性能[43]。Pd核/Pt壳结构显著提高了催化效率，并促进了电极界面处的快速电子转移。因此，该传感器为目标分析物的定量分析提供了稳定的信号输出。在本研究中，负载蒽醌（AQ）的轮状PtCuMn被用作AFB1检测的信号探针，而负载硫靛（Thi）的核壳Pd@Pt被用作OTA检测的信号探针。

为了实现高灵敏度的多目标检测，不仅需要采用高性能纳米材料进行信号放大，还需要使用具有良好的柔韧性和多个结合位点的识别元件，从而避免多目标检测过程中的相互干扰。因此，DNA纳米结构的出现完美地满足了这一要求[44]。利用DNA链的自组装能力，可以构建具有精确定义空间构型的刚性支架。例如，DNA风车结构作为理想的多位点支架，由多条单链DNA的合理设计自组装成具有多个叶片的刚性纳米结构[45]。该结构作为精密适配平台，其多个叶片使不同的信号探针能够在特定位置特异性修饰，同时精确控制其空间距离和方向。这种方法不仅有效地避免了不同识别元件之间的空间位阻，从根本上消除了信号交叉干扰，还为多目标的同时定量检测提供了可靠基础[46]。由于AFB1和OTA经常在受污染食品中共存，与单目标检测相比，双目标检测模式具有显著的实际优势。单目标检测需要对每种毒素进行单独的测试程序，导致准备和分析时间增加、样品消耗量提高以及成本上升。相比之下，双目标同时检测能够在单次测量周期内对两种毒素进行定量，大幅提高了分析通量和成本效益，同时降低了操作复杂性。与先前报道的双目标电化学适配体传感器相比，本工作中DNA风车支架与两种不同纳米材料的结合提供了独特的优势。先前报道的双目标电化学适配体传感器通常依赖单一类型的纳米材料和适配体结合来支持两个检测通道[47]，或采用可调性较差的DNA探针结构，如DNA四面体或Y形探针[48]、[49]。本研究引入了两种不同类型的纳米材料和DNA风车结构来支持两个检测通道。制备的PtCuMn和Pd@Pt能够有效放大AQ和Thi的电化学信号。DNA风车支架还为信号探针提供了空间独立的锚定位点，实现了单一结构内的多位点信号放大。

在此基础上，本研究成功构建了一种基于轮状PtCuMn、核壳Pd@Pt纳米晶体和DNA风车结构的新颖电化学适配体传感器，用于同时高灵敏检测AFB1和OTA。首先，将DNA风车纳米结构的支架固定在电极表面，并用MCH封闭非特异性结合位点。在AFB1和OTA存在时，通过磁分离将上清液和沉淀分离。互补DNA（cDNA）打开发夹结构，置换出毒素特异性信号探针使其游离。释放的信号探针随后通过碱基配对与电极固定的DNA风车支架杂交形成风车叶片。该策略不仅为AFB1和OTA的同时检测提供了高效方法，也为将DNA纳米结构与功能纳米材料相结合的多目标电化学传感器提供了新的设计理念，在食品安全分析方面具有重要的理论价值和应用潜力。

片段摘录：试剂与仪器

本实验中使用的所有DNA序列均由苏州金瑞基因生物工程有限公司合成。具体序列列于表1中。

AFB1和OTA购自Sigma-Aldrich Co., LLC。黄曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素B（OTB）和玉米赤霉烯酮（ZEN）购自上海安谱实验科技股份有限公司。伏马毒素B1（FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和T-2毒素由Acros Organics Co.提供。

材料的形貌图像使用JEM-F200透射电子显微镜获取。

电化学适配体传感器的检测原理：如图1所示，在电极外部构建了一个磁分离系统，通过空间隔离在物理上分离了两个识别系统，从而防止两个靶标识别事件之间的直接交叉干扰。对于AFB1检测，Apt-1/cDNA-1双链体通过Apt-1上的生物素标记与MBs表面包被的链霉亲和素之间的相互作用连接到磁性微球（MBs）上。对于OTA检测，Apt-2/cDNA-2双链体通过…

结论：本研究制备了轮状PtCuMn和核壳Pd@Pt纳米晶体，分别负载了AQ和Thi。采用DNA风车结构作为信号放大策略，构建了一种双通道电化学适配体传感器，用于高效同时检测AFB1和OTA。DNA风车结构具有多叶片架构，允许在单个识别单元上组装多个信号探针，而PtCuMn和Pd@Pt纳米材料可以…

CRediT作者贡献声明：
Xiaoru Hu：初稿撰写、验证、方法学、概念构思。
Yawei Huang：初稿撰写、方法学、调查、概念构思。
Zhiguang Suo：方法学、形式分析。
Tingting Wang：验证、资源。
Min Wei：审阅与编辑、监督、资源、概念构思。
Yong Liu：方法学、形式分析。

利益冲突声明：
作者声明不存在已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

数据可用性：
数据应要求提供。

伦理批准：
本研究未涉及人体或动物样本。

声明：
所描述的工作此前未曾发表。
本文未在其他地方接受出版考虑。
所有作者均已批准本文的出版，工作所在地的负责机构已默示或明示批准。
如果被接受，未经版权所有者的书面同意，本文不会以相同形式、以英文或任何其他语言在其他地方出版，包括电子出版。

利益冲突声明：
? 作者声明不存在已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢：
本研究得到国家自然科学基金（编号：32502346）和河南省重点科技项目（262102110144）的资助。

Yawei Huang | Xiaoru Hu | Tingting Wang | Zhiguang Suo | Yong Liu | Min Wei