深度学习引导的磷脂酶A2工程改造以增强其催化性能并在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达

《Food Bioscience》：Deep Learning-Guided Engineering of Phospholipase A 2 for Enhanced Catalytic Properties and Efficient Heterologous Expression in Bacillus subtilis

　　

摘要：

磷脂酶 A₂ (PLA₂) 是一种重要的生物催化剂，在食品加工、油脂精炼和生物技术中具有广泛的应用。然而，来源于天然产物的 PLA₂ 酶往往活性不足且热稳定性差，这限制了其工业应用。本研究旨在结合深度学习引导的位点筛选与组合组装，增强 PLA₂ 的热稳定性和催化活性，以生产更适合高效工业应用的催化剂。我们应用了深度学习引导的设计策略，具体利用 MutCompute 模型，识别 PLA₂ 中的突变热点。根据这些预测，我们生成了单点和组合突变体，并获得了性质显著改善的变体。N21E/I84L/Q116M 三重突变体显示出比野生型 (WT) 高 225% 的比活性，增强的热稳定性（50 °C 下半衰期从 26.69 分钟增加到 33.85 分钟），以及拓宽的活性 pH 范围（WT 仅在 pH 7.0 到 7.5 之间保持高活性，而 N21E/I84L/Q116M 在 pH 6.0–9.0 范围内保持了≥71.5% 的最大活性）。为进一步促进工业生产，我们在枯草芽孢杆菌中优化了该优越突变体的表达。优化的启动子 P₄₃-P_aprE 使表达量增加了 69.6%，最优信号肽 SP_pelB 使分泌量增强了 18.4%。最后，通过将工程化 PLA₂ 表面展示开发了全细胞生物催化剂。在大豆卵磷脂的生物转化中，该突变体全细胞生物催化剂比其野生型对照多产 48.8% 的产品。总之，本研究提出了一种全面且高效的 PLA₂ 分子工程策略，提供了一种高活性、稳定且易于表达的、非常适合工业应用的生物催化剂。

引言

磷脂酶 A₂ (PLA₂, EC 3.1.1.4) 水解磷脂 sn-2 位的酯键，生成游离脂肪酸和相应的溶血磷脂，广泛用于磷脂改性、油脂精炼、饲料添加剂、科学研究和医疗治疗 (Cerminati et al., 2019)。PLA₂ 对天然卵磷脂进行生物转化后，生成的溶血磷脂酰胆碱表现出更强的乳化性能，并能在各种工艺条件下形成稳定的乳液 (Ramrakhiani & Chand, 2011)。因此，溶血磷脂酰胆碱在食品、化妆品和制药等工业领域有广泛的应用 (De Maria et al., 2007)。

作为最早被发现的一种微生物 PLA₂，紫红链霉菌 PLA₂ 被认为是一种极具前景的工业生物催化剂，具有优异的催化性能、热稳定性和广泛的底物适应性 (Song et al., 2005)。与传统动物或植物来源的 PLA₂ 相比，它在温和的温度和 pH 条件下表现出显著的活性和稳定性，并在植物油精炼过程中的酶法脱酸中表现优异。它可以显著降低油中的磷含量，使其低于工业标准，简化了后续的精炼过程 (A. Liu et al., 2015)。在蛋制品加工、烘焙和乳制品生产等多个食品制造领域，其安全性已由欧洲食品安全局接触材料、酶和加工助剂专家组 (EFSA CEP Panel et al., 2023) 进行评估。当应用于大豆卵磷脂的增值研究时，它作为绿色催化剂显示出广阔的前景 (H. R. Lee et al., 2022)。

定向进化 (Wang et al., 2021) 和理性设计 (Zhou et al., 2024) 在酶工程中很常见。早期的结构引导策略通过针对具有高分辨率晶体学 B 因子的残基来提高热稳定性 (Reetz et al., 2006)。机器学习现在在构建文库之前优先确定替换位点 (Wittmann et al., 2021)，基于同源物之间的进化耦合 (Hopf et al., 2017) 或局部化学微环境 (Shroff et al., 2020)。在使用 FireProt 服务器进行计算后，糖基转移酶突变体 Mut8 的热稳定性和催化活性得到了提高 (M. Chen et al., 2022)。MutCompute，一种基于结构的深度学习模型 (Shroff et al., 2020)，已被应用于 PET 水解酶 (Lu et al., 2022) 和 Bst DNA 聚合酶 (Paik et al., 2023)，其中预测的替换位点得到验证并组合，以产生改进的变体。SvPLA₂ 先前的工程化工作侧重于降低毒性以提高表达量。利用 Intein 介导的自激活来降低毒性，并在酵母中表达了高活性的 PLA₂ (Cheperegin et al., 2021)。Cheperegin 等人通过 T46S 点突变、C4 延伸修饰以及糖基化位点失活叠加，获得了一种适合酵母表达的 SvPLA₂ 变体，其分泌量没有下降且毒性显著降低 (Cheperegin et al., 2020)。没有研究专门针对 SvPLA₂ 的催化活性和热稳定性，先前的工程化工作主要集中在降低其对表达宿主的毒性。

SvPLA₂ 已在毕赤酵母 (A. Liu et al., 2015) 和大肠杆菌 (Takemori et al., 2012) 中表达。Lee 等人报道了在大肠杆菌和毕赤酵母中产量提高了 8.4 倍 (H.-J. Lee et al., 2020)。然而，大肠杆菌的肠毒素限制了其在食品和制药行业的应用。枯草芽孢杆菌是食品级酶生产更合适的宿主 (K. Zhang et al., 2020)。它具有公认安全 (GRAS) 地位且不产生肠毒素。异源蛋白通过其 Sec/Tat 分泌系统直接导出到培养基中，从而避免了胞内聚集并消除了裂解细胞的必要性。这些特性避免了与大肠杆菌相关的安全风险和昂贵的纯化步骤。

在本研究中，使用 MutCompute 优先确定候选替换位点，然后通过实验验证并进行组合组装。随后采用分子对接和分子动力学模拟来阐明这些 PLA₂ 突变体稳定性和活性提高的分子机制。结合启动子工程，在枯草芽孢杆菌中实现了 SvPLA₂ 的高水平分泌表达。MutCompute 展示了高精度和效率，表现最好的突变体表现出显著改善的热稳定性、活性以及将大豆卵磷脂转化为溶血磷脂酰胆碱的效率。

章节片段

细菌菌株、质粒、化学品和生长条件

质粒和菌株如表 S1 所示。引物列于表 S2。枯草芽孢杆菌 168 和地衣芽孢杆菌 LB1ba02 用作启动子扩增的模板。SvPLA₂ 基因经密码子优化并由上海生工生物工程有限公司合成。枯草芽孢杆菌 SCK6M 用于载体构建。枯草芽孢杆菌 SCK6M 和枯草芽孢杆菌 WB800 均用于相关的发酵测试。PrimeSTAR Max DNA 聚合酶和 In-Fusion? Snap 组装酶混合液已

通过深度学习神经网络提高 PLA₂ 功能

为了确定用于工程化 SvPLA₂ 的候选替换位点，使用 3D 自监督 CNN 模型 MutCompute 筛选与其局部化学微环境不匹配的突变位点。MutCompute 使用残基原子坐标、部分电荷和溶剂可及表面积作为结构特征，并将其输入到 3D 自监督卷积神经网络 (3D-CNN 网络) 中。它基于超过 19,000 个序列平衡的蛋白质结构进行训练，可以优化野生型氨基

讨论

磷脂酶 A₂ (PLA₂) 的工业应用长期以来一直受到其有限的催化效率和在极端条件下较差的热稳定性的限制。在本研究中，我们利用深度学习引导的理性设计成功工程化了来源于紫红链霉菌的野生型 PLA₂ (SvPLA₂)，然后在经 GRAS 认证的枯草芽孢杆菌宿主中实现了其高水平分泌表达和表面展示。我们的发现提供了一种全面的分子和微生物工程策略

结论

本研究通过关注性能和表达两个方面，系统地解决了阻碍 SvPLA₂ 工业应用的挑战。使用 MutCompute 优先确定候选位点，并通过组合组装来平衡由此产生的活性 - 稳定性权衡，我们获得了 N21E/I84L/Q116M，实现了显著的双重增强：总体催化效率 (k_cat/K_m) 提高了 10.4 倍，50 °C 下的热半衰期延长了 27%。分子动力学模拟

CRediT 作者贡献声明

李盼：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，资源，项目管理，调查，资金获取，概念化。王斌：资源，概念化。潘宝祥：可视化，方法学，调查。贾航：可视化，方法学，调查。刘昭源：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，可视化，方法学，调查，正式分析，概念化

未引用参考文献

Chen 等，2024 年；Lambré 等，2023 年。

利益声明

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

没有需要声明的利益冲突。

致谢

本工作得到国家重点研发计划 (2024YFA0918300) 的资金支持。

刘昭源 | 贾航 | 潘宝祥 | 王斌 | 李盼