用于哺乳动物混合物定量宏条形码测序的新型 12S/16S rRNA 标记基因

《Food Control》：Novel 12S/16S rRNA Markers for Quantitative Metabarcoding of Mammalian Mixtures

　　

# 双标记系统实现哺乳动物定量DNA metabarcoding

• 双标记系统实现定量哺乳动物meta条形码分析。
• 在30个物种中实现100%扩增成功率，并呈现清晰的条形码间隔。
• 线粒体拷贝数变异是定量偏差的主要来源。
• 高灵敏度：0.03 ng/μL（高通量测序）和0.001 ng/μL（qPCR）。
• 0.2%的丰度阈值最大限度减少混合物中的假阳性。

## 引言

准确鉴定哺乳动物物种对于多种应用至关重要，包括野生动物犯罪调查、食品欺诈检测和法医微量物证分析，同时与饲料成分溯源及膳食科学研究密切相关，从而展现出卓越的跨学科研究意义（Iyengar等，2014；Staats等，2016；Hassan等，2023；Liu等，2023）。虽然基于细胞色素氧化酶I（COI）区域Sanger测序的DNA条形码已被广泛应用于物种鉴定（Hebert等，2003），但高通量测序（HTS）的出现使得同时分析数百万个扩增子成为可能，由此催生了DNA meta条形码技术（Taberlet等，2012；De Barba等，2014；Evans等，2016；Garrido-Sanz等，2022）。该方法越来越多地用于混合或降解样品中的哺乳动物物种鉴定。然而，传统的COI条形码（约650 bp）对于典型的HTS平台而言往往过长（Deagle等，2014）。此外，其蛋白质编码特性导致第三位密码子保守性较低（第三密码子摆动效应）——这一特征不仅增加了通用引物设计的难度，还引入了扩增偏差。这种偏差源于引物-模板错配产生的差异结合亲和力，倾向于有利于序列匹配良好的类群，而可能排除存在错配的类群（Clarke等，2014；Pi?ol等，2015；Hajibabaei等，2019；Ficetola等，2021）。值得注意的是，在复杂混合物中，此类偏差可能保持隐藏状态，这与传统条形码中扩增失败显而易见的情况不同。

近期在复杂生物混合物分析方面的进展凸显了对稳健且偏差最小化的分析框架日益增长的需求（Sheng等，2024）。与此同时，HTS技术将该领域从定性物种检测推进到定量meta条形码分析——一种将测序读段丰度与个体数量或生物量等生物学指标相关联的方法（Elbrecht & Leese，2015；Thomas等，2016；Fonseca，2018；Lamb等，2019；Shelton等，2023）。与传统DNA条形码分析相比，定量meta条形码要求分子标记满足更为严格的标准，核心目标是在PCR扩增中确保"公平性"并最大限度减少技术偏差（Nichols等，2018；Shaffer等，2025）。这些要求集中在四个关键维度上：(i) 广泛的分类学覆盖：标记必须全面覆盖目标类群，因为任何物种的扩增失败都会直接导致丰度严重低估和社区比例失调（Clarke等，2017；Hajibabaei等，2019）。(ii) 精确的引物-模板匹配：即使单个碱基错配也会引起差异扩增效率，需要靶向高度保守区域或使用简并引物以确保在所有目标物种中实现近乎完美的结合（Sipos等，2007；Stadhouders等，2010；Pi?ol等，2015）。(iii) 稳定的扩增效率：标记必须在所有目标物种中保持一致的扩增效率（90%-110%），这通过优化目标区域（例如稳定的GC含量和均匀长度）及PCR条件来实现，将种间变异控制在5%以下（Dabney & Meyer，2012；Skelton等，2023；Shaffer等，2025）。(iv) 严格的PCR偏差控制：非目标干扰（如引物偏好性、模板竞争、自我退火）必须通过严格的实验设计加以最小化，因为它们会严重破坏定量关联（Nichols等，2018；Silverman等，2021；Shaffer等，2025）。这些设计标准内在关联，往往存在权衡取舍。提高通用性通常需要更大的简并度，而这会降低特异性和效率。同时，优化某一类群的效率可能会放大对其他类群的偏差。因此，成功的引物设计依赖于平衡这些相互竞争的参数，以在广泛的物种范围内最大化扩增公平性和定量性能。综上所述，这四项要求定义了定量meta条形码的技术门槛，作为数据可靠性的核心保证，同时给分子标记筛选和验证带来了重大挑战（Alberdi等，2018）。

线粒体12S和16S rRNA基因为COI提供了有前途的替代方案。12S和16S rRNA标记通过HTS解析复杂多物种群落取得的广泛成功，凸显了其在不同生物系统中的通用性和可靠性（Vences等，2005；Cawthorn等，2012；Sarri等，2014；Elbrecht等，2016；Milan等，2020；Shi等，2020；Cheng等，2022）。在哺乳动物中，线粒体16S提供了有吸引力的标记，因为其保守特性便于通用引物设计，同时保留足够的变异用于种级鉴别（Cawthorn等，2012）。16S rRNA基因在某些类群中优于COI，例如，能够区分八个主要脊椎动物类群，而COI仅能区分两个，并在所检查的哺乳动物、鸟类和鱼类中实现100%的种级分辨率（Vences等，2005；Sarri等，2014）。在昆虫中，16S rRNA显示出更高的PCR成功率（97.6%对比COI的90.5%），且引物偏差更低（Elbrecht等，2016）。12S rRNA基因已成功用于鱼类鉴定，能够区分数十个物种（Milan等，2020；Shi等，2020）。

定量高通量测序的近期进展产生了多种改进策略，包括合成spike-in内参和精密的生物信息学校正方法，这些方法有效地实现了测序读段向绝对丰度估计的转换（Valido等，2025）。与此同时，长读段测序平台的持续升级以及与定量PCR的交叉验证进一步增强了定量结果的稳健性（Bian等，2026）。然而，必须认识到，尽管已建立多种用于物种鉴定和生物多样性调查的12S和16S rRNA引物组，但大多数是针对单模板DNA扩增设计的。在含有多模板的PCR反应中，不均一的扩增效率和类群特异性PCR偏差会产生偏离原始DNA混合物真实组成的扩增子谱（Schenekar等，2020；Valsecchi等，2020；Kumar等，2022），从而严重限制基于meta条形码的物种组成定量分析的可靠性和准确性。

大多数哺乳动物鉴定标记均为线粒体来源，然而种间线粒体拷贝数变异（Garrido-Sanz等，2022）和PCR扩增偏差均损害定量准确性——这些效应无法通过单一标记进行解耦。因此我们假设，通过双标记系统，利用跨位点验证，可以分离这些混杂效应，从而提供更可靠的定量。为检验这一假设，我们开发并验证了一个针对线粒体12S和16S rRNA基因高变区域的双标记系统（Mam_12S和Mam_16S），用于哺乳动物DNA混合物的定量meta条形码。通过计算机模拟、单物种验证以及人工构建的已知组成DNA混合物，我们整合Sanger测序、高通量测序和定量实时PCR（qPCR）来评估分类学覆盖范围、种级分辨率、扩增特异性和定量准确性（图1）。我们的具体目标是：(i) 设计和优化具有广泛分类学覆盖范围和高特异性的短标记；(ii) 通过遗传距离和系统发育分析评估物种区分能力；以及(iii) 定量评估PCR偏差和模板浓度等因素对丰度估计的影响。本研究为哺乳动物DNA混合物的定量meta条形码建立了一个严格验证的双标记框架，使在关键应用中实现丰度感知的物种检测成为可能。

## 样本采集与制备

为确保广泛的分类学代表性，我们基于已建立的哺乳动物系统发育框架选择了30个哺乳动物物种（Song等，2012；Foley等，2023）。它们的完整线粒体基因组从NCBI数据库获取。选择涵盖了八个目：食肉目（7种）、鲸偶蹄目（9种）、翼手目（1种）、兔形目（2种）、奇蹄目（3种）、灵长目（5种）、长鼻目（1种）和啮齿目（2种）（表S1）。

为实验验证引物性能，我们选择了……

## 分类学覆盖范围与种级分辨率

对30个比对完整的线粒体基因组进行 comparative 分析，确定了由保守基序两侧 flank 的两个高变区域：一个位于12S rRNA基因内（命名为Mam_12S），另一个位于16S rRNA基因内（Mam_16S）（表1）。设计的标记在涵盖8个目的30个哺乳动物物种参考数据库中显示出广泛的计算机模拟分类学覆盖范围（表S2）。实验验证确认了这一覆盖范围：两个标记均在10个测试物种中实现了100%的PCR扩增成功率。

## 解决复杂哺乳动物混合物DNA meta条形码中的关键挑战

准确鉴定复杂哺乳动物混合物中的物种面临三个主要技术障碍。首先，DNA降解以及加工（如烹饪）或环境暴露（如氧化）导致的食品基质结构复杂性增加，对分子分析构成了重大挑战，使得依赖较长DNA片段的标准条形码方法失效（Lindahl，1993；Hajibabaei等，2006；Deagle等，2014；Zhang等，2026）。

## 结论

本研究开发并全面验证了一对适用于哺乳动物DNA定量meta条形码的有效标记（Mam_12S和Mam_16S）。两个标记均提供了广泛的分类学覆盖范围、稳健的物种区分能力和可靠的定量能力，检测灵敏度分别为0.03 ng/μL（HTS）和0.001 ng/μL（qPCR）——性能指标非常适合微量DNA分析。尽管HTS读段丰度存在显著的种间偏差，但强正相关……

## CRediT作者贡献声明

Pei Yu：撰写——初稿、可视化、方法论、正式分析、数据管理。
Wei Zhang：撰写——审阅与编辑、监督、数据管理、概念化。
Changxin Wang：方法论、数据管理。
Yuanfeng Liu：方法论、正式分析。
Zhenghua Xu：方法论、数据管理。
Qifan Sun：调查、资金获取、概念化。

## 伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得公安部鉴定中心科研伦理委员会批准。（批准编号：2023-002）

## 数据与材料可用性

所有支持研究结果的数据均包含在本文及其补充文件中，以下数据集除外：高通量测序（HTS）原始数据和新产生的12S rRNA和16S rRNA Sanger序列。所有原始HTS数据已存入NCBI数据库，登录号为PRJNA1322063。新产生的12S和16S rRNA Sanger序列分别以登录号PX137935–PX138221和PX137650–PX137934存入NCBI数据库。

## 利益冲突

作者声明无利益冲突。

## 竞争利益声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

## 致谢

本研究由中国国家重点研发计划（2022YFC3341002-2）和山东省自然科学基金（ZR2023QC278）资助。

Pei Yu | Changxin Wang | Yuanfeng Liu | Zhenghua Xu | Qifan Sun | Wei Zhang