《Food Chemistry: X》：Microbial diversity and peptide dynamics during the spontaneous fermentation of whey from the Yunnan ethnic cheese Rushan
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研究人员对云南传统乳制品乳扇（Rushan）生产过程中产生的副产物乳清（Rushan whey, RW）进行了为期14天的自发发酵研究，系统分析了发酵过程中微生物多样性与肽谱（peptidome）的动态变化。在发酵第0、7、11和14天采集样本，发现细菌多样性
研究人员对云南传统乳制品乳扇（Rushan）生产过程中产生的副产物乳清（Rushan whey, RW）进行了为期14天的自发发酵研究，系统分析了发酵过程中微生物多样性与肽谱（peptidome）的动态变化。在发酵第0、7、11和14天采集样本，发现细菌多样性在发酵初期（F0d）显著高于后期，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门；瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）在发酵后期成为优势菌种，而真菌群落仅在发酵第14天被检出，主要为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）共鉴定出8532条肽段，肽段多样性随发酵进程逐渐下降，而总肽丰度在第11天达到峰值，推定生物活性肽的丰度在第7天最高。所有鉴定肽段中，源自β-酪蛋白（β-casein, CASB）的肽段在数量和丰度上均占主导地位。利用PeptideRanker工具筛选出39条推定生物活性肽，进一步通过BIOPEP-UWM数据库注释出19条具有潜在免疫调节、抗氧化、抗菌及钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶（CaMPDE）抑制等活性的肽段。曼特尔检验（Mantel test）和冗余分析（redundancy analysis, RDA）显示，细菌群落结构与肽丰度之间存在显著相关性（P < 0.01），斯皮尔曼相关性分析进一步揭示了特定细菌物种与推定生物活性肽之间的关联。该研究首次系统揭示了乳扇乳清自发发酵过程中微生物群落与肽谱的协同演替规律，为利用本土乳酸菌定向富集生物活性肽、实现乳清副产物高值化利用提供了科学依据。
**一、研究背景与科学问题**
乳扇（Rushan）是中国云南省大理白族地区生产的传统发酵奶酪，其制作过程不使用商业发酵剂，而是依靠上一批次生产所得的乳扇乳清（Rushan whey, RW）作为天然凝乳剂进行自然发酵。乳扇乳清占初始牛奶体积的比例高达90%，富含乳糖、酪蛋白、乳清蛋白、肽类、氨基酸、矿物质及水溶性维生素，为微生物生长代谢提供了良好的营养环境。然而，由于乳扇乳清有机物含量高，大量排放不仅造成资源浪费，也带来显著的环境负担。
乳清中的微生物组成受地理来源和加工条件等因素影响而存在较大差异。已有研究在意大利Caciocavallo Silano奶酪和法国PDO Comté奶酪生产的乳清中鉴定出德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等优势菌群。在对乳扇乳清的初步分析中，开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）和瑞士乳杆菌也被鉴定为优势微生物。然而，关于乳扇乳清自发发酵过程中微生物群落的动态演变规律及其与肽谱之间的关联，目前仍缺乏系统性研究。
发酵过程中，微生物将蛋白质降解为肽段。部分肽段具有免疫调节、抗菌、抗氧化、抗血栓、降胆固醇、降血糖及降血压等生物活性，对乳制品的感官品质和营养价值具有重要贡献。酪蛋白和乳清蛋白因其含量丰富且氨基酸序列明确，被认为是生物活性肽的优质前体。随着乳扇生产向工业化规模转型，乳扇乳清的高效利用及其功能性成分开发仍不充分。肽组学（peptidomics）作为分析蛋白质加工、修饰或消化后肽段组成、结构、功能及动态变化的强有力工具，为乳清肽谱研究提供了技术支撑，但目前在乳扇乳清研究中的应用仍十分有限。
基于上述背景，研究人员开展了本项研究，旨在系统解析乳扇乳清自发发酵过程中微生物多样性与肽谱的动态变化，并探究二者之间的潜在关联。
**二、研究内容与结论**
研究人员从云南欧亚乳业有限公司收集乳扇乳清样品，将单一批次乳清在室温下自发发酵14天，分别在第0、7、11和14天取样（F0d、F7d、F11d、F14d），每个时间点设置3个平行样本。通过扩增子测序分析细菌16S rRNA基因和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进行肽组学分析，并运用生物信息学工具预测推定生物活性肽，最终通过多元统计方法揭示微生物与肽谱的关联。
研究发现，发酵过程中乳酸菌大量增殖并驱动乳清持续酸化，pH从初始的5.07逐步下降至第14天的3.49。乳酸菌活菌数在早期阶段增加并在第11天后趋于平稳，而酵母菌直到第14天才被检出，活菌数达6.02 log CFU/mL。在物种水平上，F0d阶段细菌群落多样性较高，瑞士乳杆菌和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）为优势菌种；F7d阶段德氏乳杆菌成为绝对优势菌种（53.34%）；F11d阶段醋杆菌属（Acetobacter）相对丰度上升；F14d阶段瑞士乳杆菌重新成为单一优势菌种（62.99%）。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析共鉴定出30个关键差异标志物。真菌群落在前三个阶段低于检出限，仅在发酵末期被检测到，主要为酿酒酵母和库德里阿兹威毕赤酵母。
肽组学分析共鉴定出8532条肽段。肽段数量随发酵时长增加而逐渐减少（F0d: 4724条；F7d: 2691条；F11d: 1956条；F14d: 1667条）。512条肽段在四个阶段均被检出，而F0d、F7d、F11d和F14d分别含有3454、906、424和415条特异性肽段。总肽丰度在第11天达到峰值后在第14天降至最低。在所有蛋白来源中，β-酪蛋白来源的肽段在数量和丰度上均占主导地位，αS1-酪蛋白（αS1-casein, CASA1）次之。通过PeptideRanker预测，共筛选出39条推定生物活性肽（得分>0.5），其中19条经BIOPEP-UWM数据库注释具有潜在的免疫调节、抗氧化、抗菌及钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶抑制等活性。这些推定生物活性肽的丰度在第7天达到峰值，分子量主要分布在1000–3000 Da区间。曼特尔检验显示细菌群落结构与总肽及主要蛋白来源肽段的丰度呈极显著相关（P < 0.01）。冗余分析表明，发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）和德氏乳杆菌与总肽及β-酪蛋白、αS1-酪蛋白来源肽段的丰度呈正相关，而醋杆菌属和瑞士乳杆菌则呈负相关。斯皮尔曼相关性分析揭示了特定细菌物种与19条推定生物活性肽之间存在多样化的正负相关模式。
**三、方法概要**
本研究样本采集自云南欧亚乳业有限公司的单一批次乳扇乳清。核心技术方法包括：（1）细菌16S rRNA基因和真菌ITS区域扩增子测序，采用单分子实时（SMRT）测序技术，通过DADA2算法进行扩增子序列变异（ASV）分析；（2）基于10 kDa超滤离心、还原烷基化及脱盐处理提取<10 kDa肽段；（3）纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术进行肽段鉴定，使用PEAKS Studio和MaxQuant软件进行数据库搜索及半定量分析；（4）利用PeptideRanker和BIOPEP-UWM数据库进行生物活性肽的计算机模拟预测；（5）采用曼特尔检验、冗余分析和斯皮尔曼秩相关分析评估微生物群落与肽谱的统计学关联。
**四、研究结果**
**1. 自发发酵过程中pH和活菌数的变化**
乳酸菌的增殖和代谢活动驱动了乳扇乳清在自发发酵过程中的持续酸化，pH在第14天稳定于3.49。乳酸菌活菌数在早期阶段增加，第11天后达到平台期。酵母菌在第14天才被检出，数量达6.02 log CFU/mL。酸性环境抑制了竞争性细菌和酵母的活性，而发酵后期乳酸菌进入稳定期后，酸产量减少，加之菌体裂解释放的有机酸、氨基酸和肽类物质，促进了耐酸酵母的出现和增殖。
**2. 乳扇乳清中的微生物多样性**
细菌α多样性（Chao1指数）在F0d阶段显著高于后续阶段，β多样性分析显示四个发酵阶段细菌群落结构差异明显。厚壁菌门和变形菌门为全阶段优势菌门。物种水平上，F0d阶段以瑞士乳杆菌（26.59%）和乳酸明串珠菌（22.12%）为主；F7d阶段德氏乳杆菌成为优势菌种（53.34%）；F11d阶段醋杆菌属相对丰度上升；F14d阶段瑞士乳杆菌重新占据主导地位（62.99%）。真菌群落在前三个阶段低于检出限，第14天才检测到酿酒酵母和库德里阿兹威毕赤酵母的高丰度存在。LEfSe分析共鉴定出30个关键差异分类标志物，其中F0d特征性富集乳酸乳球菌、乳酸明串珠菌和约氏不动杆菌；F7d特征性富集德氏乳杆菌和发酵乳杆菌；F11d特征性富集木醋杆菌和巴斯德醋杆菌；F14d特征性富集瑞士乳杆菌。
**3. 不同发酵阶段乳扇乳清的肽组学分析**
共鉴定出8532条肽段，肽段数量随发酵进程逐渐减少。F0d阶段1000–1500 Da分子量范围内的肽段丰度较高，而其他阶段<1000 Da的肽段丰度较高。总肽丰度在第11天达到峰值，随后在第14天降至最低。β-酪蛋白来源的肽段在数量和丰度上均占主导地位。F7d和F11d阶段的肽谱较为相似，而F0d阶段呈现独特的肽段分布特征。αS2-酪蛋白来源肽段在F0d阶段的丰度高于其他阶段，提示微生物发酵并未增强该蛋白的水解；κ-酪蛋白来源的AA125–135片段在F7d阶段特异富集。
**4. 乳扇乳清中推定生物活性肽的分析**
以-10lgP > 45为筛选标准，共获得107条未修饰肽段，经PeptideRanker预测（得分>0.5）筛选出39条推定生物活性肽，其中19条经BIOPEP-UWM数据库注释具有免疫调节、抗氧化、抗菌及CaMPDE抑制等潜在活性。推定生物活性肽的丰度在第7天达到峰值，与总肽丰度峰值（第11天）存在时间差，反映了微生物蛋白水解的时序性特征。分子量分布分析显示，推定生物活性肽主要集中在1000–3000 Da区间。
**5. 细菌组成与肽丰度之间的关联**
曼特尔检验表明细菌群落结构与总肽以及主要蛋白来源肽段的丰度呈极显著相关（P < 0.01），特别是β-酪蛋白来源肽段（r ≥ 0.4）。冗余分析显示，发酵乳杆菌和德氏乳杆菌与总肽及β-酪蛋白、αS1-酪蛋白来源肽段呈正相关；乳酸乳球菌、乳酸明串珠菌等与总肽和αS1-酪蛋白来源肽段正相关，但与β-酪蛋白来源肽段负相关；醋杆菌属和瑞士乳杆菌与总肽及两类主要酪蛋白来源肽段均呈负相关。斯皮尔曼相关性分析表明，不同细菌物种与19条推定生物活性肽之间存在多样化的关联模式，瑞士乳杆菌和德氏乳杆菌均与其中8条肽段正相关、分别与6条和8条肽段负相关。
**五、讨论与结论**
本研究表明，乳扇乳清在自发发酵过程中虽然维持了一个保守的核心细菌群落，但其群落结构发生了显著变化，瑞士乳杆菌和德氏乳杆菌在发酵后期占据优势地位，而真菌群落仅在发酵末期被检测到。肽组学分析显示，肽段多样性随发酵时间延长而降低，而总肽丰度和推定生物活性肽丰度分别在发酵中期（第11天和第7天）达到峰值。β-酪蛋白是最主要的肽段来源，αS1-酪蛋白次之。生物信息学分析鉴定出39条推定生物活性肽，其中19条具有潜在的免疫调节、抗氧化、抗菌及CaMPDE抑制等功能。相关性分析证实细菌群落结构与推定生物活性肽之间存在显著关联，为利用本土乳酸菌促进生物活性肽产生提供了理论依据。
研究结论：该研究系统揭示了乳扇乳清自发发酵过程中微生物群落和肽谱的动态变化，证实发酵乳扇乳清是功能性肽的丰富来源，为通过受控微生物发酵定向富集生物活性肽序列奠定了科学基础，也为这一未被充分利用的乳制品副产物转化为高附加值功能性食品成分提供了可持续的利用策略。需要注意的是，由于当前研究基于单一批次工业乳清，自发发酵固有的变异性要求未来纳入不同季节和不同生产地点的多个独立批次进行验证。后续研究应聚焦于关键功能菌株的分离以及乳扇乳清来源肽段生物活性的实验验证。
