基于分流固相萃取策略联用超高效液相色谱-串联质谱分析同时测定红茶及绿茶中的13种热致内源性污染物

《Food Chemistry》：Simultaneous determination of 13 thermo-induced endogenous contaminants in black and green tea based on a split-flow SPE strategy coupled with UPLC-MS/MS analysis

　　

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  对红茶和绿茶中的丙烯酰胺、4-甲基咪唑和杂环芳香胺进行了同时分析。
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  分流固相萃取克服了茶叶基质复杂性和分析物性质多样的难题。
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  研究了红茶、绿茶和焙炒绿茶中13种热加工内生污染物的发生情况。
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  焙炒绿茶显示出丙烯酰胺、4-甲基咪唑和β-咔啉类的共同富集。

引言

热加工内生污染物是指食品内在成分在热加工过程中产生的潜在有害化合物，也称为热诱导污染物（Stadler & Lineback, 2009; Yu等, 2025）。典型的热加工内生污染物包括美拉德反应的有害副产物，如丙烯酰胺、甲基咪唑和热杂环芳香胺。大量证据表明，大多数热加工内生污染物存在健康隐患，具有遗传毒性和致癌性，部分还与肾脏、肺部及其他器官疾病有关（Deng等, 2017; Nishad等, 2021; Qiu等, 2021; Rungratanawanich等, 2021）。例如，近期一项针对大鼠的研究表明，同时暴露于丙烯酰胺、Nε-(羧甲基)赖氨酸和哈曼会引发显著的氧化应激反应和炎症（Quan等, 2022）。此外，联合暴露还可能导致肝脏和肾脏功能异常、肾脏病理损伤以及肿瘤发生率升高（Quan等, 2022）。这些发现凸显了不同热加工内生污染物之间存在协同或相互作用效应的可能性，可能加剧其毒性（Quan等, 2021; Quan等, 2022）。Braun等（2024）进一步阐明，即使单个化合物本身不表现出活性，化学混合物也能产生效应。具体而言，他们确定哈曼、去甲哈曼、丙烯酰胺和甲基咪唑是混合物相关风险的关键驱动因素。此外，在茶叶中大量存在的咖啡因被认为是一个关键的协同因子，可放大这些混合物效应（Braun等, 2024）。目前，已在烘焙食品、烧烤食品、咖啡及各类茶产品中发现不同的热加工内生污染物（Yu等, 2025）。

茶是全球最普遍的饮料之一，因其独特的口感、风味和大量生物活性物质而广受欢迎。然而，我们此前的研究发现，在红茶、熟茶和焙炒绿茶中已检测到多种热加工内生污染物，包括丙烯酰胺（<0.001–1.88 mg/kg）、4-甲基咪唑（<0.0003–0.40 mg/kg）、哈曼（0.0006–0.03 mg/kg）和去甲哈曼（0.0009–0.06 mg/kg）（Yu等, 2025）。考虑到不同热加工内生污染物的存在，尤其是在红茶和绿茶中（这两类茶占全球茶叶总产量和消费量的90%以上，Pan等, 2022），以及其对人类健康的潜在风险，迫切需要建立茶叶中多种热加工内生污染物的同时分析方法。

已有数项研究建立了不同基质中多种热加工内生污染物的分析方法，例如咖啡产品中的丙烯酰胺和杂环芳香胺（Xian等, 2019），烘焙食品和油炸食品中的Nε-(羧甲基)赖氨酸、Nε-(羧乙基)赖氨酸和丙烯酰胺（Cheng等, 2021），以及烧烤和烤肉中的Nε-(羧甲基)赖氨酸、Nε-(羧乙基)赖氨酸和杂环芳香胺（Li等, 2024），还有含充足淀粉、糖和蛋白质的其他热加工食品（Wei等, 2024）。然而，在茶叶基质中情况变得更加棘手，出现了双重挑战。尽管目前在其他基质中建立的方法确实解决了目标分析物性质各异（亲水性、疏水性、极性等）的问题，但茶叶基质含有大量成分（如生物碱、多酚、色素、氨基酸、挥发性酸、无机元素、脂质和矿物质等）（Ly等, 2020; Saadi Ali & Yard?m, 2024; Xu等, 2023），这导致在超高效液相色谱-串联质谱中（特别是对于丙烯酰胺和4-甲基咪唑等低分子量化合物）出现严重的信号抑制和色谱干扰（Jiao等, 2016）。在这种情况下，提高分析物提取效率会放大基质来源的干扰，而更有效的去除干扰的纯化过程往往会消除大量目标化合物（Yu等, 2025）。迄今为止，茶产品中多种类别热加工内生污染物的同时测定方法尚未建立。考虑到红茶和绿茶在发酵茶和非发酵茶基质中的典型性及其普及程度，这两种基质中多种热加工内生污染物的分析方法亟需建立。

因此，本研究旨在开发一种基于分流固相萃取策略联用超高效液相色谱-串联质谱的分析方法，用于绿茶和红茶产品中2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,8-二甲基-咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(去甲哈曼)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(哈曼)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PHIP)、1,9-二氢-2H-吡啶并[2,3-b]吲哚-2-亚胺(AaC)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)、2-氨基二吡啶并(1,2-a:3′,2′-d)咪唑(Glu-p-2)和2-氨基-6-甲基二吡啶并(1,2-a:3′,2′-d)咪唑(Glu-p-1)（其化学结构见补充材料图S1）、4-甲基咪唑和丙烯酰胺的分析。通过评估线性、定量限和回收率，对方法的准确性、精密度和稳定性进行了验证。实际应用中，所建立的方法被用于分析从当地零售商购买的真实样品。

各节摘要

化学品与试剂

11种杂环芳香胺标准品（IQ、MeIQx、去甲哈曼、哈曼、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、PHIP、AaC、4,7,8-TriMeIQx、Glu-p-2、Glu-p-1）、4-甲基咪唑、丙烯酰胺、¹³C₃-丙烯酰胺和d₃-4-甲基咪唑购自Alta Scientific Co., Ltd.。13种热加工内生污染物和2种同位素标记内标的单体储备液通过溶解于甲醇中配制。混合工作标准溶液和内标液随后通过甲醇逐级稀释制备。

结果与讨论

结果按照图1所示的实验流程呈现。首先，优化了选择性灵敏检测所需的串联质谱参数（3.1节），随后系统优化了超高效液相色谱条件（3.2节）。接着，开发了茶叶中13种热加工内生污染物分析的萃取条件（3.3节）和纯化程序（3.4节）。最后，对方法进行了系统验证（3节）

结论

成功开发并验证了一种快速、灵敏、稳健的超高效液相色谱-串联质谱方法，用于同时测定红茶和绿茶样品中13种热加工内生污染物。该方法将高效的两步萃取程序与Cleanert PCX固相萃取纯化及优化的超高效液相色谱-串联质谱条件相结合，能够在复杂的茶叶基质中实现有效分析。验证结果表明，分析性能令人满意，回收率在71.7%至118.7%之间，相对标准偏差

CRediT作者贡献声明

Yu Jiawei：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、方法论、调查研究、正式分析、数据整理、概念构思。Zhou Li：写作——审阅与编辑、监督、方法论、概念构思。Chen Zongmao：写作——审阅与编辑、监督、概念构思。Sun Hezhi：写作——审阅与编辑、方法论、调查研究、概念构思。Luning Pieternel A.：写作——审阅与编辑、可视化、监督、方法论，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本研究由国家重点研发计划（2022YFD1600803）和中国农业农村部创新计划（CAAS-ASTIP-TRICAAS）资助。

Yu Jiawei|Zhou Li|Chen Zongmao|Sun Hezhi|Luning Pieternel A.