超声处理提升发酵酪蛋白衍生肽的抗氧化活性：基于分子表征与分子动力学模拟的研究启示

《Food Hydrocolloids》：Enhancing the antioxidant activity of peptides derived from fermented casein by ultrasonic treatment: Insights from molecular characterization and molecular dynamics simulation study

　　1. 超声促进了酪蛋白与细胞包膜蛋白酶之间的相互作用。2. 超声提高了酪蛋白的溶解度，并增加了无规卷曲结构。3. 超声增强了发酵酪蛋白衍生肽的抗氧化活性。4. 肽VYPFPGPIPN与KEAP1的Ser-555位点紧密结合。5. VYPFPGPIPN在计算机模拟中表现出抗氧化潜力，并在HepG2细胞中表现出活性。引言牛奶蛋白是多种具有生理功能的生物活性肽的重要来源，包括抗氧化活性（Panchal等，2020；Y. Wang等，2025）、抗高血压活性（Z. Zhang等，2025）和免疫调节活性（Liu等，2026）。在这些蛋白质中，酪蛋白是牛乳的主要成分（Zhao等，2023），并在乳制品发酵过程中作为乳酸菌水解的主要底物。乳酸菌对酪蛋白的酶解降解有助于释放各种功能性肽（Lozo等，2011），这些肽在功能食品和营养补充剂领域具有相当大的应用潜力。然而，酪蛋白胶束复杂的胶体结构往往限制了酶的可达性（Mu?oz-Tamayo等，2012），从而降低了水解效率。酪蛋白分子具有柔性结构，能够通过疏水相互作用、静电作用和磷酸钙交联组装成胶束聚集体（Carver等，2019）。这种结构复杂性限制了酪蛋白与蛋白水解酶之间的相互作用，从而限制了发酵过程中的肽生成。因此，能够修改酪蛋白结构特征并改善酶-底物相互作用的策略已引起越来越多的研究关注。超声技术作为一种调节蛋白质结构特性的有前景的物理加工技术已崭露头角（Huang等，2019）。超声处理产生的声空化效应会产生局部高温和压力梯度、剪切力及微射流。这些效应可破坏蛋白质聚集体并诱导构象变化（Suslick和Nyborg，1990；Huang等，2019）。先前的研究已表明，超声处理能够改变酪蛋白的二级结构并提高其溶解度（Han等，2020）。然而，超声诱导的结构修饰对酪蛋白发酵系统中控制酶-底物相互作用的分子机制的影响仍认识不足。乳酸菌的一个关键特征是它们的蛋白水解系统，其中细胞包膜蛋白酶（CEP）主要将蛋白质水解为具有生物活性的肽（Ji等，2021）。瑞士乳杆菌（*L. helveticus*）以其强大的蛋白水解系统而闻名，其特征为拥有多个CEP编码基因和高酶活性（Sadat-Mekmene等，2011），使其成为发酵过程中生成肽的首选发酵剂。据报道，CEP与酪蛋白底物之间的相互作用显著影响发酵过程中的肽形成效率（Ji等，2026）。然而，超声诱导的酪蛋白结构改变对酪蛋白与CEP之间分子相互作用的影响鲜有研究。近年来，分子对接和分子动力学（MD）模拟等计算方法已成为阐明蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用分子基础的重要工具（Yan等，2025）。分子对接可预测潜在的蛋白质-蛋白质结合模式并识别关键的分子间相互作用。MD模拟能够评估不同处理条件下蛋白质的构象动力学。例如，M. Zhang等（2025）利用MD模拟研究了超声诱导的核桃蛋白构象变化，而R. Wang等（2025）利用MD模拟分析了脉冲电场对大豆蛋白结构的影响。这些计算方法越来越多地应用于食品蛋白质研究中，用于研究结构修饰、酶-底物识别机制以及生物活性肽筛选。鉴于上述，本研究旨在阐明超声处理增强瑞士乳杆菌ATCC15009发酵水解酪蛋白的机制基础，并确定超声是否能增强抗氧化肽的生成。首先，从瑞士乳杆菌ATCC15009中提取CEP，并使用生物信息学和分子建模方法分析其一级及三维（3D）结构特征。随后，通过MD模拟和分子对接分析研究超声相关机械扰动条件下CEP与不同酪蛋白亚型之间的相互作用。接下来，利用光谱方法分析不同超声处理后酪蛋白的结构特征，并评估该菌株的发酵特性及抗氧化活性。最后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、生物信息学预测及计算机模拟鉴定关键抗氧化肽，并在HepG2细胞中验证其抗氧化应激的保护作用。本研究为超声辅助蛋白质发酵的分子机制提供了新的见解，并支持从酪蛋白中高效生产功能性生物活性肽。分节摘录材料瑞士乳杆菌ATCC15009菌株购自美国模式培养物保藏中心（ATCC）。酪蛋白（蛋白质含量92%，乳提取物，Y262177），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（P0012A），5×上样缓冲液（P0015L），考马斯亮蓝快速染色液（P0017），BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012），蛋白酶活性测定试剂盒（P0403S），2,2'-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS?）试剂盒（S0119），CEP的提取与鉴定如图1A所示，去除N端信号肽后，瑞士乳杆菌ATCC15009的CEP的C端区域被预测嵌入细胞膜中，而活性区域则暴露于胞外。先前的研究报告称，CEP的C端区域可通过静电相互作用与细菌细胞表面结合（Villegas等，2015；Ji等，2021）。生物信息学分析预测其理论分子量为177.54结论本研究旨在阐明超声辅助发酵在调节酪蛋白结构、酶-底物相互作用及生物活性肽生成方面的作用。超声在酪蛋白中引起了明显的构象变化。它提高了酪蛋白的溶解度、绝对zeta电位及表面疏水性。同时，二级结构从α-螺旋结构向更具柔性的无规卷曲构象转变。这些结构变化可能会增加…CRediT作者贡献声明**Gen Li：** 形式分析。**Le Chu：** 软件、方法论。**Yinfei Ma：** 调查、资金获取、形式分析。**Xiaoxi Zhang：** 撰写-原始草稿、验证、调查。**Shuai Zhao：** 撰写-审阅与编辑、方法论、资金获取、形式分析、概念化。**Yan Zhao：** 数据管理未引用参考文献John和Carl，2019；Wang等，2025；Zhang等，2025；Zhang等，2025。利益冲突作者声明不存在利益冲突。资助本研究获得了国家重点研发计划（苹果质量控制与高效生产的关键技术及集成示范，2023YFD2301004）和江苏省食品安全与质量控制协同创新中心的支持。利益冲突声明? 作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。作者：Xiaoxi Zhang｜Yinfei Ma｜Le Chu｜Gen Li｜Yan Zhao｜Shuai Zhao