《Food Hydrocolloids》：Mung bean protein fibrils reinforce whey protein gels at neutral pH: Effects of fibril maturity, concentration, and microstructure
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乳清蛋白分离物（whey protein isolate，WPI）在中性pH下单独加热至12 wt%浓度时无法形成连续的自支撑凝胶网络，而绿豆蛋白原纤维（mung bean fibrils，MF）的引入可有效增强WPI凝胶。研究人员系统研究了原纤维成熟度（诱导
乳清蛋白分离物（whey protein isolate，WPI）在中性pH下单独加热至12 wt%浓度时无法形成连续的自支撑凝胶网络，而绿豆蛋白原纤维（mung bean fibrils，MF）的引入可有效增强WPI凝胶。研究人员系统研究了原纤维成熟度（诱导时间4、8、12 h）及浓度（0.1、0.3、0.5 wt%）对pH 7下WPI-MF复合凝胶形成与增强的影响。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、硫黄素T（ThT）荧光光谱、圆二色（CD）光谱及透射电子显微镜（TEM）表征MF的结构成熟度；通过动态流变学、扫描电子显微镜（SEM）、激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）、选择性溶剂相互作用分析、非网络蛋白含量测定及X射线衍射（XRD）评估复合凝胶性能；并利用预训练的ResNet-34卷积神经网络结合主成分分析（PCA）对CLSM图像进行定量微观结构解析。结果表明，延长酸性热处理时间（至12 h）可促进MF形成高长径比、富含β-折叠的成熟原纤维；0.3 wt% MF被识别为微观结构致密化的临界浓度。与纯WPI凝胶相比，0.5 wt% MF使凝胶储能模量（G′）从约115 Pa显著提升至约6930 Pa，非网络蛋白含量从约35.3%降至约2.0%，XRD图谱中β-折叠结晶度增强。分子间作用力分析证实，疏水相互作用是驱动WPI分子在MF支架上募集与共组装的主要作用力。该研究为设计高性能植物-乳制品混合蛋白凝胶提供了机制见解和实用策略。
**研究背景与问题**
在现代食品工业中，构建具有可控质构和保水性能的清洁标签蛋白质水凝胶仍是重要挑战，尤其是在不添加多糖和盐的配方体系中。乳清蛋白分离物（whey protein isolate，WPI）因其营养价值和多功能性被广泛应用，但其热致凝胶行为高度依赖蛋白质浓度、pH和离子环境。在pH 7下，WPI需达到较高浓度（如>12 wt%）和较高温度（如>85 °C）才能形成热不可逆的三维网络凝胶。然而，WPI作为高价值乳蛋白原料，其市场价格持续上涨，给富含蛋白质的食品配方带来成本压力。因此，在不简单提高WPI浓度的前提下提升其网络形成效率，具有重要的实际意义。已有研究尝试通过添加胶体、超声处理、分级分离以及原纤维增强复合凝胶等策略改善WPI凝胶性能。其中，蛋白原纤维因其纳米级高长径比形态、高疏水性和高刚度，被视为有效的食品级结构单元。绿豆（Vigna radiata）蛋白作为一种优质植物蛋白，其分离物（mung bean protein isolate，MPI）在酸性热处理条件下可转化为高度有序的原纤维聚集体，具备作为蛋白网络增强添加剂的潜力。尽管已有研究证明植物来源原纤维可显著增强动物蛋白凝胶，但关于植物原纤维在动物蛋白混合体系中的系统认知仍有限。多数研究仅关注原纤维浓度，忽略了原纤维成熟度的作用，而成熟度与可溶性肽段、聚集体和长原纤维之间的平衡及表面疏水基团暴露密切相关。此外，当前对复合网络微观结构的表征主要依赖定性显微镜观察，缺乏将微观拓扑结构与宏观力学性能相关联的定量描述手段。
**研究内容与结论**
研究人员系统研究了绿豆蛋白原纤维（mung bean fibrils，MF）的成熟度（诱导时间4、8、12 h）和浓度（0.1、0.3、0.5 wt%）对pH 7下WPI-MF复合凝胶形成与增强的影响。研究发现，单独12 wt% WPI在pH 7加热后不能形成自支撑凝胶，而仅添加0.1 wt% MF即可使体系转变为自支撑水凝胶。延长MF诱导时间至12 h可获得高长径比、富含β-折叠的成熟原纤维，其增强效果显著优于未完全纤维化的4 h和8 h样品。储能模量（G′）从纯WPI凝胶的约115 Pa（1 Hz）提升至12MF复合凝胶的约2867 Pa，进一步增加MF浓度至0.5 wt%时G′达到约6930 Pa。非网络蛋白含量从约35.3%（对照）降至约2.0%（0.5%MF），表明MF能有效将游离WPI募集到网络结构中。分子间作用力分析显示，疏水相互作用是驱动WPI在MF支架上吸附和共组装的主要作用力，静电相互作用和氢键也协同参与。该工作表明，植物来源原纤维可作为高效的纳米级活性支架，显著增强WPI在低于其凝胶浓度下的网络形成，为设计高性能植物-乳制品混合蛋白凝胶提供了新策略。论文发表在《Food Hydrocolloids》。
**关键方法**
研究人员采用多尺度表征手段：利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白降解程度，硫黄素T（ThT）荧光光谱和远紫外圆二色（CD）光谱表征β-折叠形成与二级结构转变，透射电子显微镜（TEM）观察原纤维形态；复合凝胶的宏观流动性通过倒瓶法评估，微观结构通过扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察；粘弹性通过动态流变学测量；分子间相互作用通过选择性溶剂溶解法区分；结晶度通过X射线衍射（XRD）分析；微观结构定量采用预训练ResNet-34卷积神经网络提取图像特征，结合主成分分析（PCA）降维。WPI原料购自新西兰Fonterra公司，MPI购自中国陕西远泰生物科技有限公司。
**研究结果**
**SDS-PAGE分析**：天然MPI在pH 2下呈现完整的球蛋白亚基条带（约50–60 kDa的8S豌豆球蛋白和约20–40 kDa的11S豆球蛋白酸性/碱性亚基）。随着加热时间从4 h延长至12 h，高分子量条带逐渐消失，低分子量（<15 kDa）肽段弥散染色显著增加，表明酸性热处理逐步水解大分子蛋白亚基，为原纤维组装提供构建单元。
**MPI原纤维表征**：视觉外观显示，加热后MPI溶液形成均一、高度浑浊的分散体系，无明显沉淀或相分离，浑浊度随加热时间增加而升高。TEM观察发现，4 h加热后体系为原纤维前体与无定形聚集体共存；8 h后原纤维明显伸长，形成无分支线性纤维；12 h后形成致密且高度缠结的成熟原纤维网络，具有半柔性形态和高长径比。ThT荧光强度在480 nm处随加热时间从约27（4MF）增至约36（12MF），确认β-折叠结构的形成具有时间依赖性。CD光谱显示，加热后样品的负椭圆峰从约205 nm（无规卷曲和α-螺旋特征）移至约227 nm，正椭圆峰出现在约195 nm，证实β-折叠结构的显著形成。
**WPI-MF凝胶宏观与微观结构**：倒瓶实验表明，12 wt% WPI单独加热后仍呈液态流动行为，而添加0.1 wt% MF即可形成自支撑凝胶。SEM图像显示，纯WPI凝胶呈有序、各向异性且方向性连续的孔道网络；加入MF后，体系转变为致密、各向同性、均一的蜂窝状网络，孔道尺寸显著减小，且随MF浓度增加（0.5 wt%）网络交联程度进一步提高。CLSM观察进一步确认，4MF凝胶呈高度不均一结构，存在分离的蛋白簇；8MF和12MF凝胶的均一性显著增强，12MF形成高度互连、致密均匀的三维网络。0.1 wt% MF凝胶已呈现连续基质，0.5 wt% MF凝胶网络致密但存在局部密集化。
**迁移学习定量微观结构分析**：预训练ResNet-34提取CLSM图像的512维形态特征，经PCA降维后，前两个主成分（PC1和PC2）共捕获52.3%的微观结构方差。PC1与结构孔隙度和空间异质性正相关，与网络密度和紧实度负相关。在成熟度系列中，4MF样品位于高PC1区域，反映高空间异质性；12MF样品形成紧密聚集簇，位于低PC1区域，表明高度均一的致密网络。在浓度系列中，0.1 wt% MF添加引起空间位置的显著跃迁，而0.3 wt%和0.5 wt% MF的散点高度重叠，表明当MF浓度达到0.3 wt%后，进一步增加浓度仅提高局部纤维密度而不改变整体拓扑结构。
**小应变流变行为**：温度扫描显示，纯WPI在加热和保温阶段的G′始终低于1 Pa，冷却后最终G′约100 Pa；所有WPI-MF样品在升温阶段G′急剧上升，且最终G′值随MF诱导时间延长和浓度增加而显著提高。频率扫描表明，各凝胶的G′和G″呈平行且轻微频率依赖，显示以非共价键（主要为疏水相互作用）控制的弹性网络特征。G′（1 Hz）从约115 Pa（Con）增至约2867 Pa（12MF），并进一步增至约6930 Pa（0.5%MF）。
**XRD分析**：所有样品在约9°和约20°（2θ）处呈现两个宽衍射峰，符合WPI聚集体的半结晶特征。12MF复合凝胶的峰强度最高，表明成熟MF诱导WPI分子形成更有序的共组装体。MF浓度从0.1 wt%升至0.5 wt%时，衍射峰强度持续增强，反映网络链增厚和结晶度提高。
**非网络蛋白含量与分子间相互作用**：Con组非网络蛋白含量高达约35.3%，而12MF组降至约3.5%，0.5%MF组进一步降至约2.0%，表明MF支架有效将游离WPI纳入网络。选择性溶剂溶解实验显示，疏水相互作用在所有样品中占主导地位，其次为静电相互作用和氢键。MF添加后各类相互作用均显著增强，且随诱导时间延长和浓度增加而持续上升：0.5%MF样品的疏水、静电和氢键贡献分别达到约41%、约28%和约17%。
**讨论与结论**
研究人员基于多尺度证据提出了WPI-MF复合凝胶的协同共组装机制：在酸性热处理过程中，MPI逐步水解并重排为高长径比的刚性MF；当MF引入中性WPI体系后，高温加热使WPI分子展开并暴露内部疏水残基，这些疏水区域优先结合到MF表面的疏水斑块上，形成以疏水相互作用为核心的模板效应，随后由静电相互作用和冷却阶段的氢键进一步巩固。WPI分子不断吸附、沉积并桥接在MF支架上，有效减少宏观相分离，最终形成高密度、均一的宏观水凝胶。研究表明，MF在低于WPI凝胶浓度条件下即可显著增强其网络形成能力，该策略为香肠、肉类替代品以及低脂乳制品中脂肪替代品等高强度植物-乳制品混合凝胶的设计提供了新途径。
