《Food Microbiology》：Investigation of the Effect of Simulated Gastrointestinal Digestive Fluids on the Infectivity of Influenza A Virus H1N1
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摘要近期高致病性禽流感（HPAI）在奶牛中暴发，引发了对潜在非呼吸道暴露途径（包括摄入受污染的生乳）的担忧。本研究评估了甲型流感病毒（IAV）在模拟人体消化过程中在牛奶中的存活情况，并利用定量微生物风险评估（QMRA）估算了感染风险。将全脂牛奶人工接种甲型流感病毒A(H1N1
摘要
近期高致病性禽流感（HPAI）在奶牛中暴发，引发了对潜在非呼吸道暴露途径（包括摄入受污染的生乳）的担忧。本研究评估了甲型流感病毒（IAV）在模拟人体消化过程中在牛奶中的存活情况，并利用定量微生物风险评估（QMRA）估算了感染风险。将全脂牛奶人工接种甲型流感病毒A(H1N1)后，分别暴露于人类唾液、含胃蛋白酶的进食状态下模拟胃液（pH 3–6）以及含胰酶的进食状态下模拟肠液中，同时设置含黏液素和不含黏液素的对照。利用空斑试验定量测定病毒感染力。唾液暴露并未降低病毒感染力；而胃部灭活作用具有显著的pH依赖性，在pH 6时约为1个对数级降低，在pH 3时约为6个对数级降低。暴露于进食状态下模拟肠液后，病毒完全失活（>6个对数级10），且不受黏液素存在与否的影响。黏液素在pH 3和pH 4.5条件下可部分保护病毒免受胃部灭活。基于实验数据开展QMRA分析，在四种剂量-反应假设下，估算每次服用的中位感染概率范围为1.35 × 10-5至1.35 × 10-8。总体而言，这些结果表明人体消化过程可显著降低受污染牛奶中流感病毒的感染力，并为流感病毒及其他可能通过生乳制品传播的包膜病毒提供食品安全风险评估的定量证据。
引言
高致病性禽流感（HPAI）A(H5N1)病毒自2020年2.3.4.4b谱系出现以来，造成了前所未有的跨物种溢出（Alkie等人，2022；FAO/WHO/WOAH，2024），并在2024年导致美国奶牛之间传播，随后扩散至多个州，并出现散发性人类感染病例（CDC；CDC，2024；FDA）。感染动物原奶中高病毒载量的存在，以及猫和鼠类摄入该原奶后发生的致命感染（Burrough等人，2024；Guan等人，2024），引发了对人类潜在非呼吸道暴露风险的担忧。
尽管流感传统上被认为是一种呼吸道疾病，但患者常报告非呼吸道并发症，如胃肠道（GI）症状（Minodier等人，2015；O'Brien等人，2020）。多项活体动物研究支持了甲型流感病毒（IAV）（包括H5N1病毒）可通过摄入或口腔/胃部接种成功引起甚至致命性感染的能力（综述见Bullock等人，2025）。此外，从重症患者的直肠拭子中分离出了具有感染力的HPAI A(H5N1)病毒（Buchy等人，2007；de Jong等人，2005）。
任何经口摄入后引起感染的病毒病原体必须能够存活于胃和肠道的消化过程，找到具有相容受体的允许性宿主细胞，并逃避肠道免疫反应（Bhunia，2018；O'Brien等人，2020）。在病毒入侵方面，血凝素（HA）是流感病毒表面的糖蛋白，可与上皮细胞表面的含有唾液酸（SA）α2,3和α2,6糖苷键结合。禽类IAV对含有α2,3糖苷键的SA具有更高亲和力，而人类IAV优先结合α2,6连接的SA（Liu等人，2023）。α2,3和α2,6 SA糖苷键在人体中的分布存在差异。例如，α2,6连接的SA受体在肠道中普遍存在，而从回肠到直肠α2,3连接的SA表达逐渐增加（综述见Dua等人，2025）。尽管预计HA在酸性pH条件下会发生不可逆的构象变化从而导致病毒在暴露于胃酸后失活，但已有研究表明病毒可通过食物和黏液的包裹得到保护（Harlow等人，2022；Hirose等人，2017）。因此，目前尚不清楚摄入受污染的食品（如乳制品）后，IAV能否在人体肠道中保持感染力。
鉴于通过摄入途径感染流感的可能性，多项研究已证明巴氏杀菌和其他热处理方法对灭活牛奶中流感病毒的有效性（Alkie等人，2025；Nasheri等人，2025；Spackman等人，2024）。然而，关于食用生乳制品后人类感染HPAI病毒的风险问题仍然存疑。为填补这一知识空白并评估摄入受污染生乳制品后的暴露后感染风险，我们将人工接种IAV(H1N1)的全脂牛奶暴露于模拟人体胃肠液中，考察病毒存活情况。随后，我们进行了定量微生物风险评估（QMRA），以估算摄入受污染牛奶后人类感染的概率。
章节摘要
细胞与病毒
Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞在含10%热灭活血清小牛血清、25 mM HEPES、1.5 g/L碳酸氢钠、20 U/mL青霉素和0.02 mg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（含丙酮酸钠的DMEM）中培养。A/荷兰/602/09 (H1N1) 病毒由西奈山医学院的Florian Krammer博士惠赠。该病毒在10日龄鸡胚蛋中37°C孵育2天扩增。经4°C过夜冷却后，
模拟消化对全脂牛奶中IAV (H1N1) 存活的影响
为考察模拟人体消化对H1N1病毒的影响，将接种H1N1的全脂牛奶暴露于人类唾液2分钟，随后暴露于添加胃蛋白酶的不同pH值FEDGAS溶液（pH 3、4.5或6）中60分钟，以及添加胰酶pH 5的FeSSIF溶液中60分钟。对于胃部消化阶段，我们考虑了3个阶段：FEDGAS pH 6（早期阶段），代表显著酸分泌之前的进食早期胃部状态；FEDGAS pH 4.5（中期阶段），模拟消化过程中的中期和持续阶段；以及
讨论
食用生或未巴氏杀菌的牛奶与食源性疾病风险增加有关，尤其是对易感人群。因此，加拿大禁止销售生或未巴氏杀菌的牛奶。巴氏杀菌是控制牛奶中多种病原体的有效策略，如沙门氏菌、志贺毒素大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和HPAI等（综述见Rabbani等人，2025）。然而，据估计美国约有1%的人口消费
CRediT作者贡献声明
Madeleine Blondin-Brosseau：撰写——初稿、方法论、形式化分析。Neda Nasheri：撰写——初稿、可视化、软件、资金获取、形式化分析、概念设计。Jennifer Harlow：方法论
未引用参考文献
CDC；FDA；USDA & FDA，2010。
利益冲突声明
? 作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究由微生物与毒理学食品安全局提供资金支持。作者感谢Caroline Gravel女士制备H1N1病毒，感谢Alex Gill博士和Sandeep Tamber博士审阅手稿并提供宝贵意见。
Madeleine Blondin-Brosseau | Jennifer Harlow | Neda Nasheri
加拿大卫生部微生物与毒理学食品安全局，渥太华，安大略省
