蜡样芽孢杆菌食品检测技术的应用进展：挑战、创新与未来展望

《Food Microbiology》：The Application Progress of Detection Technology for Bacillus cereus in Food: Challenges, Innovations and Future Prospects

　　

食品安全是全球公共卫生的关键议题。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus, B. cereus）作为一种食源性致病菌，广泛分布于自然界，可导致人和动物患病。对B. cereus的快速检测对于此类疾病的防控具有重要意义。本文详细综述了食品中B. cereus检测技术的发展历程，从传统方法到免疫学、分子生物学及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等一系列当前技术。概述了各种检测技术的原理、优缺点及其应用进展。此外，展示了不同技术联合应用在食品中B. cereus检测方面的应用与优势。CRISPR/Cas系统具有高特异性、高灵敏度和操作简便等特点，在食源性致病菌检测领域展现出巨大潜力。本文还阐述了CRISPR/Cas技术与重组酶聚合酶扩增（RPA）、侧向流动层析（LFA）及人工智能（AI）技术相结合可进一步提高检出率和准确性。上述技术能够实现食品中B. cereus的早期检测与预防，保障食品安全并防止食源性疾病暴发。本文对食品中B. cereus及其他食源性致病菌检测技术的研究具有一定的参考价值，并为保障食品安全和维护人类健康提供了有力支撑。

论文解读

一、研究背景与意义

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus, B. cereus）是一种兼性厌氧、革兰氏阳性细菌，营养需求低，对不良外界环境具有极强的适应能力，可抵抗物理因素及多种化学物质对其生长的干扰。B. cereus与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）等同属一个菌群，其16S rRNA基因序列高度同源，在形态学、生理学和生物化学特征上也表现出高度相似性。作为食源性机会致病菌，B. cereus的致病能力长期被严重低估。仅2024年，B. cereus产生的呕吐毒素和肠毒素就在欧盟和英国引发了127起登记在册的食源性疾病暴发事件，造成3315人感染、49人住院和9人死亡。根据数十年的流行病学数据，B. cereus感染的全球总体死亡率约为0.9%，其中食物中毒是最主要的感染途径，占全部感染病例的94.31%。

B. cereus在遭受高温、冷冻、超高压等各种环境胁迫时会产生芽孢以抵抗威胁，难以被彻底清除。其芽孢可通过农作物轻易进入食物链，生物膜的形成使其能够抵抗食品加工技术和各种消毒措施。B. cereus可产生两类毒素：腹泻型肠毒素和呕吐型肠毒素。呕吐型肠毒素为环状十二肽cereulide；腹泻型肠毒素主要包括细胞毒素K（CytK）、溶血性肠毒素BL（Hbl）和非溶血性肠毒素（Nhe），通过肠道定植引起食物中毒及局部或全身感染。

然而，传统金标准方法（ISO 7932，甘露醇卵黄多粘菌素MYP培养+24小时生化确认）仍遵循事后检测模式，其有效性受到系统瓶颈的制约。首先，这些检测方法假阳性率高、操作繁琐、检测效率低；其次，食品中香料、多酚等复杂成分以及乳制品中的蛋白酶会干扰检测结果，降低灵敏度；第三，实时荧光定量PCR（qPCR）和MALDI-TOF等设备价格昂贵，难以在城镇、港口或配送仓储点等区域广泛普及；第四，培养方法只能判断细菌的有无，无法即时判断菌株是否携带致病基因。目前，因检测技术滞后导致的食源性疾病案例相当普遍，因此推动B. cereus及其他食源性致病菌检测技术的创新是一项紧迫任务。

二、研究内容与主要技术方法

该研究系统综述了食品中B. cereus检测技术从传统培养方法到现代快速检测技术的发展历程，涵盖的主要技术方法包括：传统分离培养与生化鉴定技术（含改良培养基和全自动微生物鉴定系统如VITEK-2和Phoenix?-100）；免疫学检测技术（酶联免疫吸附试验ELISA和免疫层析技术）；分子生物学检测技术（常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、微滴式数字PCR ddPCR、环介导等温扩增LAMP、重组酶聚合酶扩增RPA、基因芯片技术、脉冲场凝胶电泳PFGE）；质谱鉴定技术（MALDI-TOF MS）；生物传感器技术；以及CRISPR/Cas检测技术（包括Cas12a、Cas13a和Cas12f1等效应蛋白的应用）。

三、研究结果

1. 传统检测技术

传统B. cereus检测需使用特异性鉴别培养基进行分离培养。美国食品药品监督管理局（FDA）推荐使用多粘菌素-丙酮酸-蛋黄-甘露醇-氯酚蓝琼脂（PEMBA）和甘露醇-蛋黄-多粘菌素（MYP）标准培养基。然而，卵磷脂沉淀环的重叠扩散可能掩盖部分菌落，菌落间的相互连接也给鉴定和计数带来困难。为提升检测准确性，研究人员通过改良培养基组分使B. cereus产生独特的菌落形态和颜色。Chon等人（2019）在MYP中添加头孢呋辛后提高了B. cereus检出率；Kim等人（2013）优化了血蛋黄-多粘菌素B-甲氧苄啶琼脂（BYPTA）的选择性。美国FDA实验室比较了Bacara和Brilliance两种显色培养基与MYP和PEMBA，结果显示Brilliance显色培养基对B. cereus的分离效率更高且菌落不相互连接。日本研究人员Teramura等人（2019）使用商业化NGKG、X-BC和MYP鉴别培养基对25株B. cereus进行检测，发现NGKG和X-BC可替代MYP实现更准确的检测。

生化鉴定基于各类细菌独特的酶系统，B. cereus的生化特征为不发酵甘露醇、阿拉伯糖和木糖，通常能液化明胶、还原硝酸盐、分解酪氨酸，过氧化物酶试验阳性，厌氧条件下可发酵葡萄糖。全自动微生物鉴定系统如Phoenix?-100和VITEK-2具有标准化检测流程，Phoenix?-100可同时鉴定100个样本并进行51项生化反应，VITEK-2可进行30余项生化反应。Aldeewan等人（2024）使用VITEK-2对60份乳制品进行临床检测，结果显示其具有优异的重复性和稳定性。但VITEK-2使用前需将待检菌株纯培养，且只能进行定性分析而非定量检测。

2. 免疫学检测技术

免疫学方法基于抗原与抗体的特异性识别反应，通过免疫反应制备单克隆抗体捕获目标物质（细菌或毒素），再通过酶显色或标记物信号放大实现检测。ELISA技术将抗原或抗体固定于载体上，加入酶标抗体或抗原触发反应，通过酶催化底物形成有色物质，根据颜色强度测定样本中相应抗原或抗体的含量。目前ELISA技术正趋向自动化和标准化，不仅可实现精确定量，还可检测蛋白质、激素等生物分子。Meng等人（2022）开发了MnO₂-Au纳米花型氧化酶介导的比率荧光ELISA，将传统ELISA灵敏度提高五倍，成功应用于牛奶样本中B. cereus的快速筛查。

免疫层析技术利用毛细管作用驱动样本在固相载体（如硝酸纤维素膜）上的结合反应，通过标记材料的显色或荧光在测试线处目视判读结果。江南大学食品科学实验室曾应用免疫层析技术检测牛奶和蔬菜中B. cereus肠毒素，检出限分别为2.6 ng/mL和3.28 ng/mL，验证了其在复杂食品基质中的适用性。然而，这两种技术均依赖特异性抗原-抗体反应，存在抗体交叉反应导致假阴性的风险；免疫层析检测通常需要预先富集以满足灵敏度要求。

3. 分子生物学检测技术

常规PCR检测可通过16S rRNA和毒力基因（如hblA、nheA、cytK和ces）鉴定B. cereus，还可利用持家基因（如rpoB、gyrB和groEL）进行系统发育分析、物种区分和多位点序列分型（MLST）。然而，B. cereus群的16S rRNA高度同源，仅存在少数碱基差异，无法有效区分不同物种。毒力基因检测也存在局限性，如B. thuringiensis也能产生nhe等毒素，干扰B. cereus的特异性鉴定。Sfax大学研究团队对突尼斯奶牛场环境和生乳中分离的B. cereus设计针对hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytk、bceT和ces毒力基因的引物进行常规PCR检测，结果显示不同菌株携带的毒力基因存在显著差异，部分菌株可能不携带某种毒素基因而导致漏检。基于持家基因的多位点序列分析（MLSA）比单一16S rRNA基因更能有效解析B. cereus群224株菌株的系统发育关系，但该方法主要用于实验室分型而非快速临床或现场检测。

多重PCR（mPCR）在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多个核酸片段。Kalyan等人（2010）基于hblA、nheA、cytK和cryIA靶基因设计引物并引入内部扩增对照（IAC）以避免假阴性，优化后的mPCR系统可同时检测B. cereus、B. thuringiensis和B. anthracis，对B. cereus的检出限为10³ CFU/mL。Yu等人（2017）设计ompA、invA和cesB三种特异性引物，结合叠氮丙啶（PMA）预处理消除死细胞干扰，并引入16S rRNA基因保守区通用引物作为IAC，将三种致病菌的检出限分别降至95、74和75 CFU/mL。

实时荧光定量PCR（qPCR）可在封闭系统中完成扩增和检测，减少污染并实时监测反应过程。西班牙研究人员通过建立qPCR技术体系成功实现了母乳中B. cereus的精确定量。Liu等人（2025）将B. cereus、沙门氏菌和大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）等四种病原体的特异性引物和TaqMan探针置于同一反应体系中，可在7小时内完成同步检测且特异性良好。微滴式数字PCR（ddPCR）通过液滴分配将样本分散到数万个PCR反应体系中，无需标准曲线即可获得靶基因的绝对拷贝数。Porcellato等人（2016）使用ddPCR定量检测牛奶中的B. cereus并与qPCR比较，发现ddPCR灵敏度与qPCR相当且消除了标准曲线误差，但对高丰度样本定量不准确且检测时间和成本显著高于qPCR。

环介导等温扩增（LAMP）在60-65°C恒温条件下使用4至6条引物进行核酸扩增，可通过浊度或颜色变化直接判读。Busch等人（2022）开发了两步LAMP检测方法，首先用groEL靶序列确定B. cereus群代表，再用nheB作为靶标评估产毒潜力，可快速筛查食品样本。重组酶聚合酶扩增（RPA）在37-42°C恒温条件下通过重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶的协同作用完成靶标扩增。昆明理工大学研究团队使用双重RPA（D-RPA）同时检测志贺氏菌和B. cereus，优化后可在42°C下25分钟内完成扩增，检出限分别为2.7 × 10¹和5.2 × 10² CFU/mL。

基因芯片技术可在同一芯片上并行分析大量生物信息。泰国研究团队使用高特异性肽核酸（PNA）作为探针检测B. cereus的三种基因，结果显示该系统仅对B. cereus有响应，其他物种未检测到信号，且食品基质对其影响较小。脉冲场凝胶电泳（PFGE）主要用于溯源而非初筛，通过将细菌样本包埋在琼脂糖中原位裂解获得完整DNA，经稀有限制性内切酶消化后在交替正交电场中分离不同大小的片段。Kim等人（2023）从某幼儿园采集的食品样本中分离出10株B. cereus，经分析未发现遗传同源性，证实了该技术的菌株区分能力。

4. 质谱鉴定技术

MALDI-TOF MS通过将样本与基质混合后用激光脉冲轰击使蛋白质离子化，依据飞行时间差异获得特异性质荷比图谱，每种细菌具有独特的蛋白质"指纹"。意大利研究人员对160株B. cereus群成员进行质谱分析，通过主成分分析（PCA）统计比较识别出七个不同聚类。值得注意的是，该菌群中的B. anthracis也能被可靠鉴定，在生物安全事件和快速临床诊断中具有重要价值。埃及食品卫生部门使用该技术对多个城市的样本进行检测，成功鉴定出20个不同物种的172株细菌分离物。然而，样本前处理、标准操作程序的遵循程度以及数据库数据质量等因素均会影响结果，某些菌株可能因蛋白质表达异常或数据库缺口而无法分型或被错误分类。

5. 生物传感器技术

生物传感器主要由生物识别元件和换能器组成，可将生物识别事件转化为可测量信号，具有体积小、便携、分析速度快、操作维护简单等特点。Izadi等人（2016）使用金纳米颗粒包被铅笔石墨电极（PGE）构建DNA生物传感器，能够特异性识别乳制品中的B. cereus靶序列，检出限为9.4 × 10^-12 mol/L。Zhou等人（2023）利用Cell-SELEX结合分子对接优化获得B. cereus营养细胞和芽孢阶段的高亲和力适配体，开发了哑铃形探针和微流控芯片传感器，检出限为9.27 CFU/mL，可在牛奶和米饭等多种基质中区分B. cereus和B. thuringiensis。然而，电极污染、基质效应和周围化学环境干扰对复杂电化学信号的解读构成挑战。将人工智能（AI）整合到生物传感器技术中可显著增强信号解读能力，AI算法分析复杂的电化学信号有助于区分细菌种类和估算细菌载量。

6. CRISPR/Cas检测技术

CRISPR/Cas系统本质上是细菌和古菌固有的天然免疫机制，核心在于利用RNA引导的核酸酶识别并切割外来入侵者的核酸。经人工改造后，该系统已广泛应用于病原体检测领域。Cas12a通过识别靶核酸片段侧翼的PAM（前间隔序列邻近基序）催化crRNA成熟，形成Cas12a/crRNA复合物后利用单一催化结构域（RuvC）切割单链DNA，通过降解荧光报告探针在检测系统中产生信号。

Chen等人（2018）建立的DETECTR平台基于Cas12a的反式切割特性直接检测DNA靶标，在HPV16/18分型和艰难梭菌毒素基因筛查中与PCR一致性达100%，且无需温度循环步骤。Gootenberg等人（2017）建立的SHERLOCK系统利用Cas13a的RNA靶向活性及其伴随的RNase活性，结合RPA等温扩增和T7转录，灵敏度达到attomolar水平并可区分单碱基突变。优化后的SHERLOCKv2通过引入Cas12b实现了四种病毒的同步鉴定，检测周期缩短至1小时以内。Li等人提出的HOLMES方案利用Cas12b介导的ssDNA报告分子切割，将扩增和检测整合为单步反应，反应温度37-60°C，可在1小时内完成。升级版HOLMESv2引入LAMP替代RPA，扩大了引物设计空间并增强了反应体系稳定性。Ding等人（2020）进一步优化为AIOD-CRISPR，将RPA扩增和Cas12a反式激活切割整合到同一反应体系中，完全消除了开盖操作，可通过荧光或侧向流动试纸条读取结果。

Ackerman等人（2020）开发的CARMEN平台利用微流控液滴配对技术，单个阵列可完成超过4500种组合，建立了高通量筛选的技术模式。Xu等人（2022）开发了基于CRISPR-Cas12a和RPA的微流控空间编码技术，可在单次反应中实现多种核酸的高灵敏度检测。Han等人（2025）将CRISPR-Cas12a整合到指驱动微流控装置中，结合模块化压力泵实现多种食源性致病菌的同步高灵敏度检测。

Li等人（2024）针对B. cereus肠毒素菌株的nheA/B/C基因和溶血素BL的hblA/C/D基因构建了RPA-CRISPR/Cas12a双信号输出系统，荧光定量通道和侧向流动层析（LFA）定性条带同步响应，并开发了智能手机小程序辅助条带判读。在食品基质验证中遇到多酚和脂肪等常见PCR抑制剂干扰，研究人员优化了RPA反应缓冲液组成并调整模板稀释比例，最终在牛奶和米饭样本中获得与PCR一致的检测结果，全程不超过60分钟。

Yang等人（2026）针对B. cereus的nheB基因和荧光假单胞菌开发了一锅法RPA-CRISPR/Cas12a反应。RPA试剂预先加入反应管底部，Cas12a检测试剂预包被在管盖内侧，离心混合后在37°C孵育约40分钟进行封闭检测。该系统对B. cereus的检出限为5.1 × 10¹ copies/μL，在米饭、牛奶和面食等14份真实食品样本中的检测结果与PCR完全一致。Chen等人（2025）将相同方法扩展到沙门氏菌检测，开发了单批次RPA-CRISPR/Cas12a双模式电化学侧向流动试纸条。

Cas13a属于Class 2 Type VI效应蛋白，其结构类似于Cas12a但识别RNA而非DNA作为靶标。Zhang等人（2021）基于此开发了Cas13a检测系统，省去了逆转录和核酸扩增步骤，可直接定量分析活致病菌。Zhou等人（2020）以金黄色葡萄球菌为检测靶标构建了CRISPR-Cas13a细菌检测系统（CCB-Detection），4小时内完成检测且特异性优异。

Cas12f1属于Type V-F CRISPR系统，是目前已知最小的CRISPR效应蛋白，分子量约400至700个氨基酸。该蛋白无需PAM序列即可识别特异性ssDNA靶标，在crRNA引导下实现靶ssDNA的特异性结合和切割，并激活反式切割活性非特异性降解系统中的ssDNA报告探针。其信号放大背景噪声低，在单分子检测和纳米级生物传感器整合方面具有独特优势。但目前Cas12f1主要用于临床样本的超灵敏核酸酸检测，在复杂食品基质中的稳定性和特异性仍需充分验证。

四、总结与展望

该研究系统综述了从传统培养、免疫学、分子生物学、MALDI-TOF-MS到生物传感器和CRISPR/Cas系统的技术发展历程。传统细菌培养法应用广泛但检测时间长；免疫学检测操作简便但受抗体交叉反应和预富集要求限制；分子生物学技术在灵敏度和速度上显著提升，但引物设计复杂性、基质干扰和假阳性仍是关键障碍；MALDI-TOF-MS通过蛋白质指纹实现高通量快速鉴定但设备昂贵难以普及；生物传感器整合具有显著优势但电极污染和信号噪声问题仍需解决。CRISPR/Cas系统以其高特异性和反式切割信号放大能力为B. cereus现场快速检测提供了新方向，特别是RPA与CRISPR/Cas12a的联合可在60分钟内完成检测。

未来B. cereus及其他食源性致病菌检测技术的发展趋势包括：检测设备和流程与AI结合向更智能化水平发展，AI从辅助角色转向全流程管理，可在检测早期优化crRNA序列以减少与B. thuringiensis等高度同源菌株的交叉识别，检测过程中滤除食品基质中的复杂背景噪声，检测后期实现检测结果的自主提取和判定；多种技术的深度融合与联合使用，如CRISPR/Cas技术与传感器技术深度整合，将核酸提取等初始步骤纳入同一微流控芯片形成闭环以减少污染风险；避免假阳性结果，将检测目标从细菌有无转向细菌活力和菌株潜在产毒能力，更准确评估致病情况；开发先进纳米材料，增强ELISA技术性能，并与CRISPR探针偶联以提高生物传感器的转换效率和降低能耗。

总之，食品中B. cereus检测技术正从单一技术的持续优化转向多种技术组合的系统体系。未来研究应将AI整合到整个检测过程中以提高检测结果的准确性，检测的最终目标应是定量活菌并评估其产毒潜力，通过加强材料和设备的研发以创造不同应用场景，构建覆盖食品生产、运输和消费全过程的B. cereus防控技术体系，为减少食源性疾病提供理论支持。