外源嘌呤碱基与基因工程互补增强Ligilactobacillus salivarius AR612的渗透压耐受性

《Food Microbiology》：Complementary enhancement of osmotic tolerance in Ligilactobacillus salivarius AR612 by exogenous purine nucleobases and gene engineering

　　

摘要

高密度发酵和高糖环境对益生菌株乳酸乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）施加了巨大的渗透压胁迫，导致其活性不足以用于食品工业应用、生物防腐和益生菌制剂开发。我们研究了外源核苷碱基和基因工程增强乳酸乳杆菌 AR612 高渗透胁迫耐受性的效果。通过生理评估、分子克隆和代谢组学的全面研究，发现补充嘌呤核苷碱基，特别是腺嘌呤，能够在高糖和高盐环境中提高生长表现并维持细胞完整性。糖转运相关基因（如scrA、gene0084、rbsB、lacS、artQ、manZ）、热休克响应基因（groES、gene1369）和能量代谢基因（ndh）的过表达可提高高渗透胁迫耐受性，而下调这些基因则加剧了对胁迫的敏感性。代谢组学分析鉴定出了嘌呤核苷碱基补充和基因过表达保护作用的共同调控通路，包括核苷酸代谢、磷酸戊糖途径和氨基酸代谢。在高糖培养基和红枣汁中的发酵试验证实了工程菌株的稳健性。这些结果表明，外源核苷碱基和功能基因在缓解渗透胁迫方面具有互补作用，并为提高益生菌在工业和食品应用中的功效提供了战略框架。

引言

在食品中，乳酸菌通过产生有机酸和细菌素等代谢物来提高保质期和风味，通过合成维生素和短链脂肪酸来提高营养质量（Thorakkattu等，2022）。乳酸菌还对肠道健康、免疫调节、作物病害防治和废物增值有贡献（Peruzzolo等，2025）。为了利用这些多方面的益处，乳酸菌发酵剂通过高密度发酵和冻干生产。然而，这些过程中代谢物的积累和残余电解质会引起渗透胁迫（Marcial-Coba等，2018），这可能使酶失活、损害细胞膜并降低细胞活力（Ge等，2024）。

在乳酸菌发酵过程中，渗透胁迫主要表现为盐和糖胁迫。这些微生物对盐胁迫的耐受性已有广泛研究（Li等，2015；Wu等，2016）。相比之下，关于糖胁迫的研究有限。高糖渗透环境在食品工业应用、生物防腐和益生菌设计等乳酸菌应用研究中仍然具有重要意义。因此，提高乳酸菌在高糖胁迫下的存活能力具有普遍重要性。

需要全面掌握乳酸菌的胁迫响应机制，以改善其在高糖环境中的渗透胁迫耐受性。这些机制包括细胞膜/壁修饰、转运蛋白、热休克蛋白（HSP）、DNA修复、相容性溶质系统和代谢适应。提高渗透胁迫耐受性的策略包括适应性进化、生物化学工程和代谢工程。作为必需的低分子量化合物，核苷酸通过调节细胞内pH、支持能量代谢和维持渗透平衡，在乳酸菌的生长和代谢中发挥关键作用（Meng等，2021）。培养补充核苷酸已被证明可以提高益生菌的生长、胁迫耐受性和有益代谢物产量（Klotz等，2017；Zheng等，2025）。过表达抗胁迫基因或异源表达与保护通路相关的基因等分子技术可以有效支持胁迫条件下的存活（Wang等，2025；Zhu等，2018）。很少有研究使用外源核苷酸来提高益生菌的渗透胁迫耐受性，且其内在机制尚不清楚。需要进一步深入探索并在益生菌菌株中验证抗高渗透胁迫靶点。

大多数旨在改善乳酸菌胁迫耐受性的先前研究都是单独使用外源保护剂或基因工程策略，而未探索这两种方法的潜在互补效果。虽然核苷酸可以通过调节能量代谢和膜稳定来快速缓解高渗透胁迫，但这种保护是暂时的且需要持续补充。基因工程可以提供稳定、可遗传的耐受性增强，但通常会带来代谢负担，从而影响生长和发酵性能。然而，结合外源核苷酸补充与靶向基因工程可能解决每种方法各自的局限性。据我们所知，尚没有研究系统地探讨这种互补性或阐明核苷酸干预与基因修饰在高渗透条件下之间的代谢串扰。

本研究调查外源核苷碱基是否能缓解乳酸乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）AR612的高糖胁迫。利用初步实验结果（Yang等，2026）、基于CRISPR的编辑系统和代谢工程来分析参与高糖渗透胁迫抗性中的功能基因。同时考察核苷碱基和功能基因缓解高糖胁迫机制的相似性与差异。研究结果可为益生菌在食品工业及其他高糖环境中的应用提供基础数据和技术支持。

章节摘要

菌株、培养基和培养条件

本研究使用的菌株和质粒列于表1。大肠杆菌TOP10用于质粒构建和增殖。携带质粒的大肠杆菌菌株在LB培养基（1%蛋白胨、1%氯化钠和0.5%酵母粉）中培养，根据需要添加氯霉素（Cm，12.5 μg/mL）或卡那霉素（Kan，50 μg/mL）。乳酸乳杆菌（L. salivarius）AR612及其重组菌株在MRS培养基中静置培养

外源核苷碱基缓解葡萄糖诱导的高渗透胁迫

外源补充保护剂可有效增强乳酸菌的环境胁迫抗性。嘌呤核苷酸对能量代谢和各种合成过程至关重要：例如，调节嘌呤代谢可部分缓解环境胁迫（Ma等，2016）。PurA和GuaB等相关酶分别催化核苷酸转化为腺苷和鸟苷单磷酸，已被证明可以增强细菌对氧化胁迫

结论

我们系统研究了提高乳酸乳杆菌（L. salivarius）AR612高渗透胁迫耐受性的策略，重点关注外源核苷碱基补充和关键功能基因过表达。结果表明，Ade、Gua和Xan通过维持细胞膜稳定性及优化细胞内能量和核苷酸代谢有效减轻高渗透损伤。基因工程研究发现，参与碳水化合物转运的关键基因

CRediT作者贡献声明

杨勇：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、方法论、调查、形式分析。宋新：撰写——初稿、方法论、获取资金、形式分析。夏永君：撰写——审阅与编辑。盛义：撰写——审阅与编辑、监督、资源、调查、数据整理、概念化。爱连忠：撰写——审阅与编辑、项目管理、获取资金、数据整理、概念化。

利益冲突声明

作者之间不存在利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（批准号U23A20261、U24A20467）和上海市食品微生物学工程研究中心（批准号19DZ2281100）资助。

杨勇|宋新|夏永君|盛义|爱连忠

上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系，中国上海，200240