免疫球蛋白重链与κ轻链重组中心敲除小鼠的发育及免疫表型比较分析

《Immunobiology》：Recombination-center ablation of Igh and Igκ defines distinct developmental and immune phenotypes in mice

　　

中文翻译（摘要） 免疫球蛋白位点的遗传学破坏早已确立了重链和轻链重排对B细胞发育的必要性。在本研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9介导的关键重组中心元件缺失，生成了-KO、Igκ-KO以及Igh/Igκ双敲除（double-KO）小鼠，并进行了协调一致的平行表型分析。与已建立的重链缺陷模型一致，Igh敲除导致B细胞发育在前B细胞（pro-B）阶段之后发生严重阻滞，伴随外周B细胞和体液效应细胞群的显著丧失。与经典的Igκ靶向研究一致，Igκ敲除通过补偿性的Igλ利用允许了显著的B细胞发育。在此匹配的实验框架内，Igκ缺陷小鼠还显示出脾脏和腹腔B细胞亚群组成的改变，而Igh缺陷小鼠则表现出脾脏和胸腺T细胞数量减少、Foxp3+调节性T细胞丰度降低以及次级淋巴组织结构改变。总之，这三种突变系提供了一个比较遗传学资源和表型参考，用于评估确定的Igh和Igκ损伤在多个免疫区室中的后果。

论文解读文章

一、研究背景与研究目的

B细胞受体（BCR）是由膜结合免疫球蛋白（mIg）与恒定信号异二聚体CD79A（Igα）和CD79B（Igβ）组成的多蛋白复合物。V(D)J重组是组装免疫球蛋白重链和轻链可变区外显子的独特遗传过程。在B细胞发育过程中，功能性重链的表达允许形成前BCR并通过pro-B到前B细胞（pre-B）的检查点，随后进行轻链重排、表面BCR表达和进一步成熟。然而，现有的遗传小鼠模型——如μMT模型、J_H缺失小鼠、CD79A/Igα或CD79B/Igβ缺陷模型等——分别扰乱了免疫球蛋白表达、BCR信号传导或B细胞谱系操作的不同分子层面。尽管这些模型已被广泛使用，但缺乏在相同遗传和实验框架下对重链和κ轻链重组中心敲除进行系统性、并行的比较分析。此外，轻链同种型的使用是一个相关问题：在野生型小鼠中约95%的B细胞表达Igκ，只有少数表达Igλ。经典研究已证实Igκ缺失可通过补偿性Igλ利用产生B细胞，但这一现象对B细胞亚群组成、体液免疫效应群体及T细胞稳态的具体影响尚未得到全面解析。

因此，本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术同时靶向< />位点的远端D_H4-1至所有J_H片段以及Igκ位点的Jκ-Cκ区域，生成Igh-KO、Igκ-KO和Igh/Igκ双敲除小鼠，并在同一实验框架内进行协调的流式细胞术和组织水平分析，以明确区分由Igh缺陷引起的共有表型和特异性与Igκ缺失相关的表型变化。

二、主要关键技术方法

研究人员采用CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过原核显微注射法递送至C57BL/6J小鼠受精卵中，以靶向删除Igh位点（染色体12）的远端D_H4-1至J_H1-4区间和Igκ位点（染色体6）的Jκ-Cκ区域。通过连续杂交杂合子创始鼠，建立了三个纯合品系：Igh^-/-（Igh-KO）、Igκ^-/-（Igκ-KO）和Igh^-/-/Igκ^-/-（Igh/Igκ-KO）。研究使用了基因组PCR和Sanger测序验证基因型，采用免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清免疫球蛋白表达，通过多参数流式细胞术分析骨髓、脾脏、腹腔和胸腺中的免疫细胞亚群，并运用苏木精-伊红（H&E）染色和多重免疫荧光（IF）染色观察次级淋巴器官的组织结构和细胞空间分布。

三、研究结果

3.1 Igh和Igκ重组中心缺陷小鼠的生成与验证

通过基因组PCR和Sanger测序确认了目标重组中心区域的缺失。还原条件下的血清免疫印迹显示，Igκ-KO小鼠保留了可检测的免疫球蛋白重链（HC）但缺乏κ轻链（κLC），而Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠缺乏可检测的HC和κLC；非还原条件下，Igh缺陷组未检测到完整的Ig复合物，Igκ-KO小鼠的完整Ig复合物减少。ELISA进一步表明，Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠的主要血清重链同种型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM）处于或接近本底水平；Igκ-KO小鼠中多种血清同种型虽降低但仍可检测到，Igκ缺失而Igλ仍可检测到，符合补偿性λ轻链利用。

3.2 Igh和Igκ缺陷差异性地扰乱骨髓B细胞发育

通过基于Hardy分群策略的多参数流式细胞术分析发现，Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠的总骨髓细胞数无显著差异，但B220⁺细胞的绝对数量和频率均大幅降低。在早期祖细胞区室中，Igh-KO小鼠的前前B细胞和前B细胞早期阶段的绝对数和相对频率较野生型（WT）显著增加；Igh/Igκ-KO小鼠相应增加的幅度较小，其前前B细胞绝对数显著低于Igh-KO小鼠。然而，两种Igh缺陷基因型的早期前B细胞均显著耗竭，成熟B细胞几乎完全丧失。相比之下，Igκ-KO小鼠保留了大量的B细胞谱系，但成熟B细胞（IgM^int/high IgD⁺）比例显著下降，同时伴随更早期未成熟群体的增加。

3.3 Igh和Igκ缺陷差异性地改变脾脏B细胞区室

Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠脾脏总细胞数显著减少，总脾B细胞（B220⁺CD19⁺）的频率和绝对数均大幅降低，下游成熟、过渡、边缘区（MZ）和滤泡（FO）B细胞群体几乎完全耗竭。Igκ-KO小鼠脾脏总细胞数与WT相当，但总脾B细胞减少约40%。值得注意的是，Igκ-KO小鼠中MZ B细胞（CD21/35^high IgM⁺）的频率和绝对数均显著增加，而FO B细胞减少，过渡B细胞也减少。

3.4 Igκ缺陷伴随补偿性Igλ利用和稳态体液效应群体的维持

流式细胞术分析显示，Igκ-KO小鼠脾脏CD3^-B220⁺细胞中Igκ⁺细胞消失，Igλ⁺群体从WT中的约5%增加到超过40%，绝对数也相应增加。浆母细胞（PB，TCR-β^- CD19⁺ CD138⁺ MHC II⁺ IgM⁺）和浆细胞（PC，TCR-β^- CD19^- CD138⁺ MHC II^- IgM⁺）在Igκ-KO小鼠中的绝对数和百分比均与WT相当；而Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠中PB和PC几乎完全丧失。

3.5 Igh缺陷与脾脏和胸腺T细胞丰度的改变相关

在Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠中，虽然脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞的相对频率显著升高，但其绝对数因脾脏总细胞数的收缩而显著降低。CD44/CD62L定义的效应记忆（EM）、中央记忆（CM）和初始亚群的频率在各基因型间大致相当。胸腺分析显示，Igh缺陷组中CD4单阳性（SP）和CD8 SP胸腺细胞的绝对数减少，双阳性（DP）胸腺细胞数在Igh-KO中基本维持但在Igh/Igκ-KO中减少，双阴性（DN）胸腺细胞数在Igh缺陷组中降低。DN1-DN4各亚群的分布在各基因型间大体相似。

3.6 Foxp3分析揭示Igh缺陷小鼠中调节性T细胞丰度降低

通过细胞内Foxp3染色分析，Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠脾脏中CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）的绝对数和频率均显著降低，而Igκ-KO小鼠与WT相当。胸腺中也观察到类似模式：Igh缺陷组的Treg绝对数显著减少，Igh-KO小鼠的Treg频率也显著降低。进一步分析显示，中央Treg（cTreg，CD44^lowCD62L^high）的绝对数在Igh缺陷组的脾脏和胸腺中均显著减少，而效应Treg（eTreg，CD44^highCD62L^low）的绝对数无显著差异。

3.7 Igh和Igκ缺陷差异性地影响腹腔B细胞区室

Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠的腹腔总细胞数显著减少，B-1（IgM⁺CD19⁺CD23^-）和B-2（IgM⁺CD19⁺CD23⁺）细胞几乎无法检测到。Igκ-KO小鼠的腹腔总细胞数与WT相当，总腹腔B细胞绝对数略有减少但频率不变。B-2细胞在Igκ-KO中显著减少，而B-1细胞（包括B-1a和B-1b亚群）的绝对数和频率与WT相比无显著差异，但B-1a的频率显著增加。

3.8 Igh缺陷与次级淋巴器官结构改变相关

Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠脾脏体积显著缩小，H&E染色显示脾脏白髓（WP）区域减少且界限不清，淋巴结皮质-髓质组织紊乱、滤泡结构不清晰。免疫荧光染色显示，Igh缺陷组脾脏中CD19⁺B细胞滤泡几乎缺失，CD3⁺T细胞在白髓区域内重新分布；淋巴结中也观察到B细胞区组织破坏和T细胞空间分布改变。Igκ-KO小鼠的脾脏和淋巴结中CD19⁺B细胞区仍可检测到，但空间组织与WT不同。胸腺的皮质-髓质组织在各基因型间基本保持完整。

四、讨论与结论

讨论部分总结： 本研究将Igh-KO、Igκ-KO和Igh/Igκ-KO小鼠置于同一实验框架内，通过协调的流式细胞术和组织水平分析，实现了对重链与κ轻链重组中心敲除在多个免疫区室中表型的直接比较。Igh缺陷基因型定义了共同的下游B细胞耗竭模式、体液效应群体丧失、T细胞/Treg丰度改变以及次级淋巴结构的显著重塑。Igκ缺陷则通过Igλ利用保留了大量B细胞发育，但伴随脾脏和腹腔B细胞亚群的选择性再分布。单敲除与双敲除的直接比较进一步揭示了残余早期祖细胞区室的定量差异，这是单独分析任一基因型所不能发现的。研究指出，在Igκ-KO小鼠中，免疫球蛋白库测序、BCR信号分析和Igλ表达的靶向操作有助于阐明λ主导库与改变的边缘区、滤泡和腹腔B细胞组成之间的关系；Igh-KO和Igh/Igκ-KO小鼠间前前B细胞区室的差异为进一步研究轻链位点活性和祖细胞存留提供了机会；对于T细胞表型，混合骨髓嵌合体、移植或谱系限制性方法有助于区分Igh缺失的直接效应与B细胞丧失和淋巴微环境改变的间接后果。

研究结论翻译： 本研究的主要贡献是在共同遗传背景下对< />、Igκ及联合Igh/Igκ重组中心敲除进行了匹配的并行表型鉴定。该框架为B细胞研究和人源化抗体开发中比较和解释免疫球蛋白工程小鼠模型提供了一个实验对齐的参考，同时也为未来关于λ主导库和B-T细胞稳态相互作用的研究奠定了基础。