谷氨酰胺酶脱酰胺增强乳清蛋白的耐热性与耐离子性

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Glutaminase deamidation reinforces thermal and ionic resilience of whey proteins

　　

摘要

乳清蛋白（WP）在电解质条件下的巴氏杀菌过程中受热产生的浑浊是开发半透明、货架稳定的饮料时面临的主要挑战。本研究采用酶促脱酰胺化方法来解决这一挑战并阐明其内在机制。乳清蛋白经蛋白谷氨酰胺酶（PG）脱酰胺化处理后，在0–100 mM NaCl存在下于75°C加热30分钟。脱酰胺化乳清蛋白（D-WP）在所有测试的NaCl浓度下均保持了超过90%的溶解度，且浑浊度低于13.9%，而WP在50–100 mM NaCl条件下的浑浊度达到54.3–99.3%，同时溶解度损失20–30%。透射电子显微镜（TEM）显示，在相同NaCl浓度下，D-WP的聚集体比WP更小。D-WP的表面疏水性和二硫键含量也低于WP。差示扫描量热法（DSC）结果显示，在较高NaCl浓度下，WP的焓变（ΔH）降低，而D-WP的焓变无论NaCl浓度如何均保持稳定。固态核磁共振（NMR）弛豫测量进一步表明，在高盐条件下，脱酰胺化保留了更大的蛋白质结合水和更加受限的局部构象环境。货架稳定性测试显示，D-WP的浑浊度增加速度较慢，在100 mM NaCl条件下储存三周后最终浑浊度仍低于30%。总体而言，PG诱导的脱酰胺化通过限制盐促进的结构失稳和聚集体增长，降低了WP对NaCl的敏感性，从而改善了电解质条件下的热稳定性和储存稳定性。

引言

随着消费者对蛋白饮料需求的增长，全球即饮蛋白饮料市场在2025年达到18亿美元，预计到2034年将达到31亿美元（IMARC Group, 2026）。乳清蛋白因其高营养价值、温和口感、易于消化和高溶解度，是此类应用中最广泛使用的蛋白原料之一（Rittmanic, 2006）。然而，为确保微生物安全性并延长货架寿命而通常进行的巴氏杀菌或灭菌等热处理，通常会导致蛋白展开、聚集和沉淀。这会降低饮料的视觉澄清度（Deeth & Lewis, 2016）和口感（Ji, Cornacchia, Sala, & Scholten, 2022; Ryan et al., 2012）。盐类的存在会加速沉淀，盐常作为电解质添加到乳清蛋白饮料中以支持持水力、维持渗透压平衡并增强口味（Evans, Miller, Whiteley, & James, 2017; Wald & Leshem, 2003）。这一问题对于旨在用于运动和电解质补充饮料的半透明乳清蛋白配方尤为相关。含有NaCl的商业透明乳清蛋白饮料通常提供的钠含量对应于约10–40 mM的NaCl当量，而关于乳清蛋白热稳定性和离子稳定性的研究通常将NaCl浓度扩展至约100 mM，以在更显著的电解质条件下评估蛋白行为（Ryan et al., 2012; Zhong, Wang, Hu, & Ikeda, 2013）。NaCl会部分屏蔽乳清蛋白的表面电荷并减弱静电排斥（Hussain, Gaiani, Jeandel, Ghanbaja, & Scher, 2012）。因此，蛋白分子可以更接近彼此，促进分子间相互作用，尤其是在高温下（Wijayanti, Bansal, & Deeth, 2014）。这会促进形成更大的聚集体，导致更高的浑浊度和更低的货架稳定性（Schmitt, Bovay, Rouvet, Shojaei-Rami, & Kolodziejczyk, 2007; Zhang et al., 2024）。

现有策略，包括pH调节（Sobhaninia, Nasirpour, Shahedi, Golkar, & Desobry, 2018）、多糖络合/偶联（Mulcahy, Park, Drake, Mulvihill, & O'Mahony, 2016; Peinado, Lesmes, Andres, & McClements, 2010）、螯合剂和增稠剂添加（Zhao & Xiao, 2017）、酶解水解（Kleekayai, Singh, & FitzGerald, 2024）以及过氧化氢处理（Sutariya & Patel, 2017），已被用于缓解盐条件下蛋白聚集。然而，这些方法或会引入异味、需要严格的配方控制，或在低酸至中性环境中难以维持稳定性（Doost, Nasrabadi, Wu, A'yun, & Van der Meeren, 2019; Li & Zhu, 2024; Sinha, Radha, Prakash, & Kaul, 2007）。酶促脱酰胺化已成为一种替代策略（Wei et al., 2025）。它催化谷氨酰胺侧链酰胺基团转化为谷氨酸，从而在低酸条件下增加净负表面电荷（Martínez, Ferreira, & Musumeci, 2022）。这增强了静电排斥作用，抑制了加热条件下的分子间聚集（Jiang et al., 2022），如乳清蛋白（Miwa, Yokoyama, Nio, & Sonomoto, 2013）和蛋清蛋白（Liu et al., 2022）所示。我们此前的研究提供了初步证据，表明酶促脱酰胺化以剂量依赖方式提高了乳清蛋白的热耐受性（Wei, Mahdavi-Yekta, et al., 2025）。然而，这种保护作用是否能在更复杂的配方条件下维持仍不清楚。这对于乳清蛋白饮料尤为重要，其中常加入NaCl等电解质，但可能促进热诱导的蛋白缔合和聚集。由于盐可能会屏蔽脱酰胺化引入的额外负电荷，它可能抵消脱酰胺化所带来的热诱导聚集减少效应，这需要进一步阐明。此外，虽然盐对乳清蛋白加热过程中聚集的影响高度依赖于浓度，但对于脱酰胺化乳清蛋白是否也存在类似的剂量依赖行为仍不清楚。解决这些空白将有助于推进对热处理后脱酰胺化乳清蛋白在广泛盐浓度范围内的溶液澄清度和储存稳定性的理解，特别是在聚集体特征方面的理解。

在本研究中，我们考察了酶促脱酰胺化赋予的热保护是否在NaCl浓度从0增加到100 mM时仍然存在。首先使用互补的物理化学分析手段表征了溶液稳定性、聚集体特征、蛋白表面性质、分子间相互作用和热行为的变化。进一步利用固态NMR弛豫测量分析了蛋白结合水和局部分子运动性，并利用摩擦学分析了与口腔加工相关的润滑行为。还进行了冷藏储存评估，以确定加热后改善的稳定性是否得以维持。因此，本研究界定了脱酰胺化诱导的热耐受性的NaCl依赖性，并考察了其分子和功能后果。

章节摘要

材料与化学品

乳清蛋白（WP）由Hilmar Ingredients公司提供（Hilmar, CA, USA），蛋白含量约89%，水分4.5%，灰分2.5%，脂肪0.5%，乳糖1.5%。谷氨酰胺酶（PG-500, 632 U/g）由天野酶公司（Amano Enzyme Inc., Nagoya, 日本）慷慨提供。NaCl及其他分析级化学品购自Fisher Scientific（Carlsbad, CA, USA）。整个实验过程中使用Barnstead E-Pure水纯化系统（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）制备的超纯水（25°C时电阻率为17.2 MΩ·cm）。

浑浊度动力学与溶解度

WP的浑浊度随加热时间增加，无论是否添加不同浓度的NaCl均如此（图1A ；表S1）。加热前，所有样品的浑浊度均保持在2%以下，不同样品之间未见显著差异（p > 0.05）。在0和10 mM NaCl条件下，WP溶液的浑浊度从10到30分钟增加不到50%，而在50和100 mM NaCl条件下则增加了约165%。最快速的增加发生在50和100 mM条件下的10到20分钟之间。

结论

本研究证明，酶促脱酰胺化通过降低乳清蛋白对盐促进的聚集和结构失稳的敏感性，在广泛的NaCl浓度范围内增强了其热耐受性，加热后聚集体表观尺寸较WP减少了46.6–78.3%。稳定性的改善与高盐条件下蛋白相互作用改变和蛋白结合水增加有关，并在润滑性方面带来了相应的益处。

CRediT作者贡献声明

Lai Wei：初稿撰写、可视化、验证、调查、正式分析、数据整理。Athanasios Gregory Flessas：可视化、验证、调查、正式分析、数据整理。Marjan Hossain Onik：调查、正式分析。Pu Duan：调查、正式分析。Paul Alba：稿件审阅与编辑。Da Chen：稿件审阅与编辑、可视化、验证、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念设计。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或可能影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本研究得到Dairy Management Inc.（资助编号：4037-0）和普渡大学农业学院的资金支持。资助方在研究设计、数据收集与分析或解释、手稿准备或决定投稿出版中均未参与。作者感谢Amano Enzyme Inc.提供谷氨酰胺酶PG-500。电子显微镜实验在普渡电子显微中心（RRID: SCR_022687）的仪器设备上完成。

Lai Wei | Athanasios Gregory Flessas | Marjan Hossain Onik | Pu Duan | Paul Alba | Da Chen

美国普渡大学食品科学系，745 Agriculture Mall Drive, West Lafayette, IN 47907, USA