《PLOS One》：Identification of transcriptomic signatures associated with an ac4C related gene set and candidate expression based clusters in osteoarthritis through integrative bioinformatics
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目的：鉴定与骨关节炎（osteoarthritis, OA）相关的转录本，这些转录本与预定义的N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac4C）相关基因集存在重叠，并评估其作为探索性分类特征及基于表达聚类的潜在基础。
方法：研究人员分析了五个
目的：鉴定与骨关节炎（osteoarthritis, OA）相关的转录本，这些转录本与预定义的N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac4C）相关基因集存在重叠，并评估其作为探索性分类特征及基于表达聚类的潜在基础。
方法：研究人员分析了五个GEO数据集，采用差异表达、功能富集、加权基因共表达网络分析、免疫特征评分、机器学习、SHAP解释、共识聚类及基因集变异分析。预定义的2,135个基因集来源于已发表的野生型与NAT10缺陷型HeLa细胞之间的ac4C-RIP-seq比较，仅用于候选基因筛选。研究人员将12种算法组合为113条两阶段特征选择/分类流程，并根据开发队列及两个外部评估队列中的受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC）均值进行排序。保留的五个基因通过qRT-PCR在IL-1β处理的原代小鼠软骨细胞中评估，每组设置三个生物学重复。
结果：在441个差异表达基因中，有8个与ac4C相关基因集重叠。三条流程共享最高平均AUC（0.910）。具有代表性的glmBoost–Naive Bayes流程在开发队列、GSE114007和GSE169077中分别达到AUC 0.883（95% CI，0.783–0.959）、0.980（95% CI，0.880–1.000）和0.867（95% CI，0.600–1.000）。由于两个次级队列参与了流程排序，这些估计值属于探索性评估而非独立验证。最终保留五个基因，包括PCOLCE、KAZALD1、PDE3A、CRIP1和ID1。Kazald1、Pde3a、Crip1和Id1在白细胞介素-1β处理后显示出名义上显著的升高，而Pcolce则无显著变化。免疫特征差异及两种聚类解决方案均为探索性结果。
结论：研究人员鉴定了一个与预定义ac4C相关基因集关联的五基因OA相关转录组特征。这些发现具有假设生成性质，并未确立直接的ac4C修饰、独立的临床有效性或可重复的分子亚型。
骨关节炎（osteoarthritis, OA）是最常见的慢性退行性关节疾病，以进行性软骨退变、软骨下骨重塑、滑膜炎症及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）破坏为特征。尽管传统上被视为机械驱动性疾病，但越来越多的证据表明OA涉及遗传易感性、炎症反应、代谢异常和组织修复失调等多种因素。目前，OA发病和进展的分子机制尚未完全阐明，也缺乏可靠的早期诊断和亚型分层生物标志物。N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac4C）是一种保守的RNA化学修饰，存在于tRNA、rRNA和mRNA中，可增强mRNA稳定性、翻译效率和解码保真度。ac4C相关调控网络的失调已被认为与多种人类疾病相关，但其在OA中的作用仍不清楚。本研究基于已发表的ac4C-RIP-seq比较（野生型与NAT10缺陷型HeLa细胞）得到的2,135个ac4C相关基因集，将其与OA差异表达基因重叠，旨在鉴定候选表达特征并探索基于表达的OA样本分组。
研究人员整合了五个GEO数据集，其中开发队列合并GSE51588、GSE113825和GSE117999（包含人膝关节软骨下骨和软骨样本，属于混合组织来源），GSE114007和GSE169077作为外部评估队列并参与模型排序。分析流程包括差异表达分析、功能富集、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、免疫相关转录组特征评分、113种机器学习流程比较、SHAP解释、共识聚类和基因集变异分析（GSVA）。最终保留的五个基因通过qRT-PCR在IL-1β处理的原代小鼠软骨细胞中进行了mRNA水平验证，每组三个生物学重复。
主要关键技术方法包括：使用limma识别差异表达基因（DEGs），阈值设为|log2 fold change|>0.585且校正后P<0.05；使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集；使用WGCNA构建共表达网络并筛选与OA显著相关的模块；使用ssGSEA计算28种免疫细胞相关特征评分；将12种算法组合为113条两阶段特征选择/分类流程，按AUC均值排序；使用SHAP解释保留模型；使用ConsensusClusterPlus进行共识聚类；使用GSVA比较亚型间通路活性差异。所有计算均在R 4.3.3中完成。
结果部分：
**OA中DEGs的鉴定**：经ComBat校正后，以|logFC|>0.585和校正后P<0.05为标准，共鉴定出441个DEGs，其中281个上调、160个下调。
**DEGs功能富集分析**：GO分析显示DEGs富集于骨化、ECM组织、胶原蛋白含量等生物过程，ECM结构成分、糖胺聚糖结合等分子功能；KEGG分析显示富集于蛋白质消化吸收、ECM受体相互作用、氮代谢等通路。
**WGCNA**：保留6,061个基因构建共表达网络，软阈值为6（R2=0.9），共识别六个模块，其中grey60模块（965个基因）与OA相关性最强，被保留用于后续分析。
**OA中acRDEGs的鉴定**：DEGs与2,135个ac4C相关基因集取交集，得到8个ac4C相关差异表达基因（acRDEGs），均在OA中上调。此重叠仅用于候选筛选，不证明直接ac4C修饰。
**免疫相关转录组特征分析**：ssGSEA评分显示OA样本中CD56dim自然杀伤细胞、滤泡辅助T细胞和效应记忆CD4 T细胞特征评分升高，而未成熟树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞等评分降低。8个acRDEGs与不同免疫细胞特征存在相关性，但这些评分反映预定义转录程序富集，并非直接免疫细胞丰度。
**机器学习算法整合用于诊断模型开发**：在113条流程中，glmBoost–Naive Bayes、Stepglm[both]–Naive Bayes和Stepglm[backward]–Naive Bayes共享最高显示平均AUC 0.910。选择glmBoost–Naive Bayes作为代表配置，其在开发队列、GSE114007和GSE169077中的AUC分别为0.883、0.980和0.867。由于外部队列参与排序，这些结果属于探索性外部评估而非独立验证。
**Hub OA-acRDEGs验证**：保留五个基因PCOLCE、KAZALD1、PDE3A、CRIP1和ID1，均在OA样本中上调。qRT-PCR显示Kazald1、Pde3a、Crip1和Id1在IL-1β处理后显著升高，而Pcolce无显著差异，因此四个计算候选基因在mRNA水平得到部分支持。
**SHAP分析**：SHAP显示五个基因对模型输出的贡献方向和大小不同；全局特征重要性排序为CRIP1（0.163）、PCOLCE（0.119）、PDE3A（0.100）、KAZALD1（0.092）、ID1（0.042）。SHAP仅解释模型输出，不证明生物学因果。
**五基因分类特征的探索性可视化**：基于五个基因构建列线图，校准曲线显示预测概率与观测概率在分析队列内表现尚可；决策曲线显示在部分阈值范围内净获益高于“全部治疗”和“均不治疗”策略。但这些均为同队列内的表观性能评估，不构成外部验证。
**Hub OA-acRDEGs的分子分型**：共识聚类在k=2时显示出相对清晰的模块结构，将OA样本分为C1（n=25）和C2（n=30）。C2亚型中PCOLCE、KAZALD1、PDE3A和ID1显著上调，CRIP1无显著变化。该两簇解未在独立数据集中验证，属于探索性分组。
**GSVA富集分析**：与C1相比，C2组在蛋白聚糖代谢过程、胶原三聚体复合物、胶原代谢过程，以及ECM受体相互作用、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素、O-聚糖生物合成等通路中评分较高；而过氧化物酶体、IgA产生的肠道免疫网络、背腹轴形成等通路评分较低。
讨论部分总结了本研究的发现：五个候选基因与ECM重塑、免疫相关转录特征及表达分组相关；但ac4C关系仅基于重叠基因集，未直接测量ac4C修饰；免疫特征评分不能定量免疫细胞丰度；机器学习特征为探索性，外部队列参与排名可能带来选择乐观性；两簇分子分型为假设生成。局限性包括回顾性设计、混合组织来源、临床信息不完整、未进行多重校正、qRT-PCR样本量小且缺乏蛋白水平和体内验证。未来需采用前瞻性锁定流程、完整计算归档、直接ac4C谱分析、NAT10扰动、正交免疫验证以及人类软骨和体内功能实验。
研究结论可翻译为：总之，PCOLCE、KAZALD1、PDE3A、CRIP1和ID1被保留在一个探索性OA相关转录组特征中。qRT-PCR为KAZALD1、PDE3A、CRIP1和ID1提供了部分mRNA水平支持，而PCOLCE在当前IL-1β处理的软骨细胞模型中未达到显著差异。三条候选流程共享最高的显示平均AUC，glmBoost-Naive Bayes作为代表配置被保留。由于两个外部队列均参与了模型排序，外部性能属于探索性评估而非独立验证。免疫特征关联、列线图和两簇解决方案均为假设生成性质。在得出机制或临床结论之前，需要直接的ac4C测量、完整的计算文档、更大规模的独立生物学验证、蛋白质和功能实验以及前瞻性评估。
