### 中文标题 m6A甲基转移酶Mettl16在果蝇发育中的功能及其对U6 snRNA修饰与选择性剪接的调控

《PLOS Genetics》：Role of the m6A methyltransferase Mettl16 in Drosophila development

　　

N6-甲基腺苷（m6A）是RNA上最丰富的化学修饰之一，由METTL3及其他数种甲基转移酶（包括METTL16）安装。尽管METTL16已在多个模式生物中得到表征，但其在果蝇中的功能仍属未知。本研究中，研究人员发现，与哺乳动物不同，果蝇Mettl16突变体能够存活，但表现出多种发育和行为缺陷。雄性和雌性突变体均不育，并伴有严重的配子发生缺陷。Mettl16突变体生殖细胞可通过有丝分裂和减数分裂阶段，但在精子延长和个体化过程中存在缺陷。Mettl16-GFP主要定位于细胞核，其缺失不会损害翅成虫盘上皮细胞的整体蛋白质合成。MeRIP-Seq分析表明，Mettl16缺失仅影响一小部分转录本的m6A修饰，与Mettl3的广泛效应形成对比。研究人员进一步证明，Mettl16与U6 snRNA相互作用，并为其m6A修饰所必需。相应地，Mettl16突变体表现出广泛的选择性剪接改变。综上，Mettl16突变体的多效性表型很可能源于其在m6A沉积和U6依赖性剪接调控中作用于特定靶转录本的功能。

### 论文主体内容解读

**研究背景与科学问题**

表观转录组学涵盖mRNA和非编码RNA上超过170种化学修饰，其中N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA上最丰富的内部修饰，参与发育、干细胞调控、免疫应答、记忆形成及肿瘤发生等多种生物学过程。m6A由包括METTL3-METTL14催化核心（MAC）及METTL16在内的多个“写入器”安装。METTL16在进化上高度保守，从细菌、酵母到脊椎动物均有同源物，其已知功能包括修饰U6 snRNA的m6A以及调控SAM合成酶（MAT2A）mRNA的稳定性与剪接。尽管METTL16已在多个模式生物中被研究，其在果蝇中的生物学功能此前完全未知。果蝇作为研究RNA修饰与剪接调控的重要模型，其性别决定系统已帮助鉴定多个m6A MACOM组分，但Mettl16的体内功能亟待阐明。本研究旨在填补这一空白，系统解析Mettl16在果蝇发育中的功能与分子机制。

**研究内容与结论**

研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Mettl16的两个突变等位基因，发现与哺乳动物中METTL16敲除导致早期胚胎致死不同，果蝇Mettl16突变体可以存活，但表现出蛹化和羽化延迟、翅膀外展、飞行不能、攀爬能力受损以及两性不育等多种发育与行为缺陷。通过Mettl16-GFP敲入品系，研究人员确认Mettl16是一种广泛表达的核蛋白，且其缺失不影响整体翻译效率。定量LC-MS和MeRIP-seq分析表明，Mettl16仅影响一小部分转录本的m6A修饰，远少于Mettl3的靶标数量；研究人员进一步证实Mettl16与U6 snRNA发生物理和遗传相互作用，并负责其m6A修饰。转录组层面的rMATS分析显示，Mettl16缺失导致广泛的选择性剪接改变，其中以5'剪接位点（A5SS）和跳过外显子（SE）事件最为显著。这些结果揭示了Mettl16在果蝇中主要通过U6 snRNA的m6A修饰调控RNA剪接，进而影响发育和生殖过程。

**关键技术方法**

研究人员使用了多种关键技术：利用CRISPR/Cas9生成Mettl16缺失突变体，并构建Mettl16-GFP基因敲入品系进行蛋白定位；通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA-seq分别分析m6A修饰谱和转录组表达变化；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS）定量mRNA整体m6A水平；利用m6A免疫沉淀（m6A-IP）结合Northern blot验证U6 snRNA的m6A修饰变化；通过RNA免疫沉淀（RNA-IP）证明Mettl16与U6 snRNA的体内结合；使用rMATS软件进行差异剪接分析；此外还运用OPP掺入实验评估蛋白质合成、免疫荧光染色和透射电镜观察精子发生过程。果蝇品系来自Bloomington果蝇中心、清华大学果蝇中心和Vienna果蝇资源中心。

**研究结果**

**1. Mettl16突变体表现出多种发育和行为表型**

通过CRISPR/Cas9生成两个Mettl16等位基因（Mettl16^1-9和Mettl16^Δ33），并利用覆盖该基因的缺陷染色体进行反式杂合验证，确认均为功能缺失突变。突变体虽可存活，但蛹化和羽化时间延迟约24至48小时，多数个体翅膀无法正常折叠而呈现外展或上举姿势，且完全丧失飞行能力，攀爬能力显著受损。

**2. Mettl16是一种广泛表达的核蛋白**

qPCR显示Mettl16在卵巢、脑、生殖腺、成虫盘、肠道、脂肪体、唾液腺和睾丸等多种组织中均有表达，以卵巢和脑中表达最高。Mettl16-GFP敲入品系的免疫荧光染色表明，该蛋白在翅成虫盘、精巢和卵巢的生殖细胞与体细胞中均定位于细胞核，与DAPI共定位良好。

**3. Mettl16突变体在雄性和雌性中均不育**

雌性突变体卵巢明显小于对照，缺乏成熟卵室，卵母细胞标志物Orb的定位异常；雄性突变体精囊中无成熟精子。通过基因组片段构建的转基因回复系可完全恢复雌性生育力和卵巢形态，证明Mettl16是果蝇卵子发生所必需的。

**4. Mettl16突变体在精子延长和个体化中存在缺陷**

突变体精母细胞可通过有丝分裂和减数分裂，形成圆形精子细胞，但精子尾部延长仅达睾丸长度的一半，且缺乏个体化复合体（IC）和凋亡“废袋”。透射电镜进一步显示，突变体中轴丝-线粒体复合物仍被包裹在同一质膜内，细胞质残留明显，表明个体化过程受阻。该缺陷可被基因组转基因完全拯救。

**5. 消耗Mettl16不影响翅成虫盘的翻译效率**

OPP掺入实验显示，在翅成虫盘后部区域敲降Mettl16或过表达Mettl16均不改变OPP信号水平；利用Mettl16^1-9突变体进行克隆分析同样未见翻译效率改变，说明果蝇Mettl16并非整体翻译调控因子。

**6. Mettl16在果蝇中仅甲基化一小部分RNA**

LC-MS定量显示，Mettl16突变体poly(A)⁺ RNA的m6A/A比值仅下降约10%。MeRIP-seq分析发现，Mettl16突变体中显著降低的m6A峰仅有186个（Mettl3突变体为2460个），表明Mettl16是靶向少数转录本的特异性甲基转移酶。结合RNA-seq数据，共鉴定出27个同时具有m6A峰降低和表达改变的候选直接靶基因。

**7. 在正常条件下Mettl16不甲基化Sams mRNA**

与哺乳动物和线虫不同，果蝇Mettl16在正常培养条件下不在Sams（SAM合成酶）转录本上沉积m6A，也不影响其mRNA或内含子4的水平，提示该调控机制在果蝇中可能不保守或仅在特定条件下激活。

**8. Mettl16介导果蝇U6 snRNA的m6A修饰**

MeRIP-seq数据显示，U6 snRNA上的m6A峰在Mettl16突变体中显著减弱；独立的m6A-IP Northern blot证实，突变体中U6 snRNA的m6A富集明显下降，而总U6水平不变。RNA-IP实验证明Mettl16-GFP可与U6 snRNA特异性结合。遗传上，Mettl16突变体在U6 snRNA杂合缺失背景下变为致死，提示两者存在剂量敏感性的遗传互作。

**9. Mettl16缺失广泛影响RNA剪接事件**

rMATS分析显示，Mettl16突变体中共有大量差异选择性剪接事件，其中A5SS最为丰富，其次是SE和内含子保留（RI）。RT-PCR验证了部分代表性事件，基因组回复构建体可恢复多数基因的正常剪接。此外，Mettl16与U6加帽酶Amus存在物理相互作用，突变体中Amus调控的内含子保留事件同样发生改变，进一步支持Mettl16通过U6修饰影响全局剪接。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，果蝇Mettl16突变体可存活但多效性缺陷明显，与小鼠中METTL16的必需性形成对比，说明该酶在进化中的功能已发生分化。Mettl3突变体也表现出类似的行为异常，但两者的分子机制可能不同。在正常条件下未发现Mettl16对Sams mRNA的调控，提示该功能可能具有物种特异性。Mettl16的主要分子功能是修饰U6 snRNA，进而影响特定前体mRNA的剪接保真度；当U6剂量减半时，突变体的剪接功能储备不足导致合成致死。研究结论表明，Mettl16突变体的多效性表型并非源于单个基因的失调，而是m6A在U6 snRNA和特定靶mRNA上缺失所导致的剪接异常累积效应。这项研究首次系统阐明了果蝇Mettl16的体内功能，为理解m6A修饰在剪接调控和发育中的时空特异性提供了新视角。