四重实时荧光定量PCR同时检测结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群和类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立与临床评估

《PLOS Pathogens》：Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium avium complex, and Burkholderia pseudomallei in clinical specimens

　　

有效控制结核病、非结核分枝杆菌（NTM）病和类鼻疽依赖于快速准确的实验室诊断。结核分枝杆菌复合群（MTBC）仍是公共卫生优先关注对象，而NTM感染，特别是鸟分枝杆菌复合群（MAC），正日益受到重视，并可能被误诊为结核病。由类鼻疽伯克霍尔德菌引起的类鼻疽在流行地区常被漏诊。这些感染的临床表现相互重叠，传统诊断方法可能无法准确区分这些疾病。研究人员开发了一种四重实时荧光定量PCR检测方法（TAM-mPCR），用于同时检测MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌，靶向基因为IS6110、rrs和BPSS1187。研究人员于2024年至2025年间在泰国两个地点收集了来自疑似结核病患者的607份肺部和肺外标本。检测限分别为MTBC 2 pg/反应、MAC 0.1 ng/反应、类鼻疽伯克霍尔德菌 50 fg/反应，分析特异性为100%。对于MTBC检测，TAM-mPCR显示出100%的灵敏度（330/330）和99%（189/191）的特异性。所有三份经培养确认的MAC标本均被检出。对于类鼻疽伯克霍尔德菌，该检测方法显示出73.2%的灵敏度（30/41）和100%的特异性（79/79）。对于MTBC，TAM-mPCR与核酸扩增试验（NAAT）和培养结果显示出高度一致性，但与抗酸杆菌（AFB）镜检结果差异显著（P<0.001）。该检测方法还检出了常规诊断遗漏的额外MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌感染病例。TAM-mPCR能够实现快速的病原体同步检测与鉴别，有望改善结核病与类鼻疽共流行地区的病例发现和患者管理。

研究背景

结核病和类鼻疽是热带地区具有重大公共卫生意义的主要传染病，两者均与高发病率和死亡率相关。在泰国，每年报告超过2500例经培养确诊的类鼻疽病例，估计病死率约为40%；而结核病仍是全球主要的传染病死因之一。这两种疾病的临床表现经常重叠，包括长期发热、肺炎和脓肿形成，并共享糖尿病和免疫抑制等共同风险因素。这种相似性常导致诊断不确定性、治疗延误和不恰当的临床管理。

此外，非结核分枝杆菌（NTM）病，尤其是由鸟分枝杆菌复合群（MAC）引起的感染，在结核病流行地区日益被认为是重要的机会性病原体，其临床表现和影像学特征与结核病极为相似，极易被误诊为结核病。同时，结核分枝杆菌复合群（MTBC）与类鼻疽伯克霍尔德菌的共感染病例在过去十年中屡有报道，尤其在印度和世界卫生组织西太平洋地区，这些病例与严重症状和高死亡率相关。

目前的常规诊断方法存在明显局限。传统培养虽然是金标准，但耗时长、资源密集，且多局限于区域或省级实验室。抗酸杆菌（AFB）染色虽快速廉价，但灵敏度有限且无法进行菌种水平鉴别。现有的分子检测方法大多针对单一病原体，若要确定肺部感染的病因，需要额外的时间、人力和成本。因此，迫切需要一种能够同时、快速、准确地检测MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌的综合诊断方法。

研究目的与结论

为了应对这一诊断缺口，研究人员开发了一种名为TAM-mPCR的院内四重实时荧光定量PCR检测方法，用于在一个反应体系中同时检测MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌。该检测方法利用IS6110作为MTBC特异性靶点，rrs靶点检测MTBC和MAC保守的16S rRNA区域并结合IS6110的扩增模式进行区分，BPSS1187作为类鼻疽伯克霍尔德菌特异性靶点，并以人类RNase P基因作为内参对照。

研究人员利用2024年至2025年间从泰国东北部两个研究点（乌汶叻差他尼府第十区疾病预防与控制办公室和苏林医院）收集的607份临床标本对该检测方法进行了评估。结果显示，TAM-mPCR对MTBC的检测表现出卓越性能，灵敏度达100%，特异性为99.0%，与核酸扩增试验（NAAT）的一致性极高。对于MAC，该方法成功检出了所有三份经培养确认的阳性标本。对于类鼻疽伯克霍尔德菌，与培养相比，灵敏度为73.2%，特异性为100%。更重要的是，TAM-mPCR在常规诊断结果为阴性的标本中发现了额外的MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌感染，包括两例MTBC-类鼻疽伯克霍尔德菌共感染病例。这项研究表明，TAM-mPCR作为一种强大的多重诊断工具，能够提高结核病和类鼻疽共流行地区的诊断准确性，减少漏诊，并识别出可能被传统单病原体诊断流程遗漏的共感染病例。

主要关键技术方法

1. 1.
   四重实时荧光定量PCR检测方法（TAM-mPCR）的开发：研究人员设计并优化了一个包含四个靶点的四重PCR体系，分别针对MTBC特异性插入序列IS6110、MTBC和MAC共有的16S rRNA基因（rrs）、类鼻疽伯克霍尔德菌特异性基因BPSS1187，以及作为内参的人类RNase P基因。
2. 2.
   临床标本采集与处理：从泰国东北部两个研究点（乌汶叻差他尼府第十区疾病预防与控制办公室和苏林医院）收集了607份残留临床标本（504份肺部标本和103份肺外标本）。不同研究点采用了不同的痰液前处理方法（2% NALC/NaOH溶液或4% NaOH）和DNA提取方法（magLEAD 12gC系统或QIAamp DNA Mini Kit）。
3. 3.
   参考标准的定义：为每个目标病原体分别定义了参考标准。MTBC阳性定义为至少一项常规NAAT（如Xpert MTB/RIF、线性探针分析法或实时荧光定量PCR）阳性或分枝杆菌培养阳性。MAC阳性定义为培养分离出MAC并经菌种确认。类鼻疽伯克霍尔德菌阳性定义为细菌培养阳性。共感染定义为同时满足MTBC和类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性标准。
4. 4.
   统计分析：使用灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和准确度评估诊断性能，采用Cohen‘s kappa系数评估一致性，并使用McNemar检验比较配对结果。

研究结果

优化和分析性能

研究人员优化了引物浓度，将阳性结果的阈值定义为Cq值 ≤ 40个循环。TAM-mPCR的检测限分别为MTBC 2 pg/反应（约4.2 × 10²基因组当量/反应），MAC 0.1 ng/反应（约1.9 × 10⁴基因组当量/反应），类鼻疽伯克霍尔德菌 50 fg/反应（约6.3基因组当量/反应）。在对16种非目标细菌物种的测试中，该检测方法显示出100%的分析特异性，无交叉反应。

在肺部和肺外标本中的诊断性能

• •
  MTBC检测：总体而言，TAM-mPCR实现了100%的灵敏度、99.0%的特异性、99.4%的阳性预测值和100%的阴性预测值，与参考标准的一致性近乎完美（κ = 0.99）。在肺部和肺外标本中的灵敏度均为100%。
• •
  MAC检测：所有三份经培养确认的MAC标本（两份肺部，一份肺外）均被TAM-mPCR检出，而在101份培养阴性标本中未出现阳性结果。
• •
  类鼻疽伯克霍尔德菌检测：在41份来自培养确诊类鼻疽患者的AFB阴性标本中，TAM-mPCR检出30份阳性。与培养相比，灵敏度为73.2%，特异性为100%，阴性预测值为87.8%，一致性为中等（κ = 0.78）。在11份TAM-mPCR阴性病例中，检测的标本（痰液或尿液）与培养阳性的标本（血液或脓液）不匹配。
• •
  共感染检测：TAM-mPCR在两份标本中检测到MTBC-类鼻疽伯克霍尔德菌共感染，并通过测序确认了两种病原体的靶点身份。

与AFB、培养和NAAT方法的比较

• •
  与AFB镜检相比，TAM-mPCR对MTBC的检出率更低，两者差异显著（P < 0.001），因为AFB无法区分MTBC和NTM。
• •
  与培养相比，TAM-mPCR对MTBC的灵敏度为100%，特异性为86.8%，一致性为中等（κ = 0.89），无显著差异（P = 0.063）。五份培养阴性但TAM-mPCR阳性的标本可能反映了培养的局限性。
• •
  与NAAT相比，TAM-mPCR对MTBC的灵敏度为100%，特异性为99.5%，一致性近乎完美（κ = 0.996），无显著差异（P = 1.000）。
• •
  对于类鼻疽伯克霍尔德菌，TAM-mPCR与培养相比显示出73.2%的灵敏度和100%的特异性，但两者之间存在显著差异（P = 0.001）。

相对于常规方法的增量价值

• •
  在AFB阳性标本中，TAM-mPCR在82.7%中检出MTBC，0.6%中检出MAC，并在一份标本中发现共感染。
• •
  在AFB阴性标本中，TAM-mPCR在20.5%中检出类鼻疽伯克霍尔德菌，在4.1%中检出MTBC。
• •
  在培养阴性标本中，TAM-mPCR额外检出了14.7%的MTBC。
• •
  在NAAT阴性标本中，TAM-mPCR额外检出了3.4%的类鼻疽伯克霍尔德菌、1.7%的MAC和0.6%的MTBC。

总结讨论与结论

讨论部分指出，TAM-mPCR对MTBC的高灵敏度（100%）和阴性预测值（100%）表明其在排除结核病方面具有重要价值，尤其在与NAAT的一致性极高的情况下。相比之下，AFB镜检会产生更多假阳性结果，因为它无法区分MTBC与NTM，可能导致不必要的抗结核治疗。对于MAC，尽管阳性标本数量有限，但初步结果显示TAM-mPCR具有鉴别诊断潜力，这对于避免将MAC感染误诊为结核病至关重要。

对于类鼻疽伯克霍尔德菌，73.2%的灵敏度低于预期，但这在很大程度上是由于研究设计中存在标本不匹配问题：11份TAM-mPCR阴性标本检测的是痰液或尿液，而培养阳性结果来自同一患者的血液或脓液。因此，这不应被视为真正的假阴性。在所有使用匹配标本的30个病例中，TAM-mPCR均成功检出。这表明，对于类鼻疽，一次来自AFB检测后剩余标本的阴性TAM-mPCR结果并不能完全排除其他解剖部位的感染。

研究还强调了TAM-mPCR在识别MTBC-类鼻疽伯克霍尔德菌共感染方面的独特价值。此类共感染可能因临床表现重叠而被低估，而TAM-mPCR能够同时检测两种病原体，有助于避免诊断延误和治疗不当。TAM-mPCR在常规方法（AFB、培养、NAAT）阴性标本中发现的额外阳性病例，突显了其作为补充诊断工具的增量价值，尤其是在资源有限、培养周转时间长的区域实验室。

研究结论：TAM-mPCR提供了一种稳健的多重诊断方法，可同时检测MTBC、MAC和类鼻疽伯克霍尔德菌。它识别替代病因和MTBC-类鼻疽伯克霍尔德菌共感染的能力，相较于传统的单靶点方法具有重要优势，有望提高诊断效率，支持其作为结核病和类鼻疽流行地区的辅助诊断工具。未来的前瞻性研究需进一步明确其在常规临床实践中的应用价值。