埃及伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性：不同杀虫剂浓度下转录组应答的机制解析

《PLOS Pathogens》：Resistance to pyrethroids in Aedes aegypti: Insights into transcriptomic response to different insecticide concentrations

　　

摘要 杀虫剂喷洒是控制登革热暴发的常用策略，但其有效性因蚊虫种群抗药性的发展而受到损害。在本研究中，研究人员对一株具有显著抗性发展能力的埃及伊蚊（Aedes aegypti）品系，施加了两种不同浓度的氯氰菊酯（permethrin）和高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin）控制性杀虫剂压力。研究人员分析了每种浓度下被增强的抗性机制，并利用RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）鉴定了与这些暴露水平特异性相关的转录本。研究旨在揭示不同杀虫剂浓度触发的分子机制，并区分化学结构不同的I型与II型拟除虫菊酯之间的应答差异。结果表明，击倒抗性（knockdown resistance, kdr）突变仅赋予中等水平的抗性，解毒酶的作用亦如此。对于高效氯氟氰菊酯，研究人员鉴定出参与电子传递链、线粒体功能及整体氧化应激应答的基因。tRNA转录本以及线粒体和应激应答转录本也出现上调，提示存在代谢转变，尤其是在氧化应激下维持稳态的转变。这些变化指向在该种群中，除直接解毒外，维持对此II型杀虫剂抗性的机制。相反，氯氰菊酯诱导了表皮基因、CYP450基因（尤其是CYP4家族）以及气味结合蛋白（Odorant Binding Proteins, OBPs）的显著过表达。这些表达模式连同代谢酶，指向解毒、减少渗透甚至隔离杀虫剂等机制，且均随浓度升高而增强。这种基因的过度调控提示一种整合性应答，与经典的代谢解毒互补，并伴随线粒体复合物的过度调控。研究表明，尽管氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯作用机制相似，但在此埃及伊蚊种群中引发了截然不同的应答。研究还表明，转录组应答依赖于杀虫剂浓度，并可能调节杀虫剂耐受性。本文推进了对埃及伊蚊拟除虫菊酯抗性复杂性的理解，并强调了在媒介控制规划中同时考虑杀虫剂类型和使用浓度的重要性。

一、研究背景与目的

拟除虫菊酯类杀虫剂因其对人类的不良反应少于有机磷类，被广泛用于控制埃及伊蚊（Aedes aegypti），该蚊种是登革热及其他虫媒病毒的主要传播媒介，在哥伦比亚等热带地区构成重大公共卫生问题。然而，拟除虫菊酯的广泛持续使用已导致蚊虫种群抗药性的选择与发展。目前已知的主要抗性机制包括电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel, vgsc）基因中的击倒抗性（knockdown resistance, kdr）突变，以及由解毒酶介导的代谢抗性。尽管存在这些认知，田间干预措施的效果常不稳定，部分原因是喷洒无法在家庭环境中可靠地传递致死剂量，且拟除虫菊酯的驱避效应短暂。在此背景下，理解不同杀虫剂浓度如何影响蚊虫，对于抗性管理至关重要。低浓度通常选择具有协同效应的累积性状，而高浓度则有利于具有强抗性表型的稀有突变。本研究选取氯氰菊酯（I型拟除虫菊酯）和高效氯氟氰菊酯（II型拟除虫菊酯），二者化学结构不同——后者含α-氰基——且在哥伦比亚田间种群中均有使用记录。研究旨在阐明抗性机制如何因拟除虫菊酯类型（I型与II型）及不同杀虫剂浓度而异，具体考察* kdr*等位基因频率、解毒酶活性及基于RNA-seq的转录组应答三个关键组分。总体假设是，埃及伊蚊的抗性机制同时取决于拟除虫菊酯类别和暴露浓度，靶位点突变、代谢解毒和基因表达应答各有不同贡献。

二、主要技术方法

研究人员使用来自哥伦比亚Acacías、Meta地区、2016年采集的AF品系（该品系在无杀虫剂压力下维持13代后仍保有固有抗性）。实验设计为：将AF品系亚群在连续两代中分别暴露于氯氰菊酯或高效氯氟氰菊酯的低浓度（LC₂₅）或高浓度（LC₇₅）。关键技术包括：采用CDC瓶式生物测定法确定诊断剂量（diagnostic dose, DD）和诊断时间（diagnostic time, DT）并施加选择压力；采用世界卫生组织（WHO）幼虫生物测定法验证抗性并计算抗性倍数（resistance ratio, RR）；通过等位基因特异性PCR（AS-PCR）检测* kdr*突变（F1534C、V410L、V1016I）；通过生化测定评估乙酰胆碱酯酶（AChE）、α/β-酯酶（α-EST/β-EST）、混合功能氧化酶（MFO）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性；并对F2代存活（抗性）与死亡（敏感）个体及低浓度选择品系进行RNA-seq转录组分析，以AF品系为对照，鉴定差异表达基因（DEGs）。

三、研究结果

AF品系在杀虫剂压力下存活率提高。 通过死亡率-时间曲线确定，高效氯氟氰菊酯的DD为24 ppm、DT为35分钟，氯氰菊酯的DD为150 ppm、DT为35分钟。经概率分析确定LC₂₅和LC₇₅：高效氯氟氰菊酯为3.65和7.5 ppm，氯氰菊酯为27.99和65.69 ppm。经过两代选择，所有选择品系的死亡率均显著低于AF原始种群，表明存活率显著提高。

拟除虫菊酯选择品系具有比AF品系更高的抗性倍数。 幼虫生物测定显示，所有品系（包括未选择的AF）相对于敏感参考品系Rockefeller均表现为抗性。与未选择AF相比，高效氯氟氰菊酯选择的HL品系RR₅₀增加12.3倍，LL品系增加4.3倍；氯氰菊酯选择的HP品系RR₅₀增加2.9倍，LP品系增加1.4倍。高浓度选择品系与AF差异显著。

等位基因频率对两轮杀虫剂压力反应微小。 三个* kdr*位点的等位基因频率在选择前后变化不大。V410L突变频率在选择品系中为0.68-0.73，略高于AF的0.55。V1016I频率在各品系间无显著差异。F1534C突变在选择品系中近乎固定（野生型频率仅0.02）。这些微小差异不足以解释观察到的RR差异。

酶活性在氯氰菊酯暴露的蚊虫中发生改变。 高效氯氰菊酯选择品系（HL、LL）的AChE、α-EST、β-EST活性显著低于AF，仅GST活性高于Rockefeller。氯氰菊酯选择的HP品系AChE、MFO、GST活性显著高于AF，且HP的AChE、α-EST、β-EST活性高于LP。这表明酶活性应答模式与杀虫剂类型和浓度相关。

转录组分析。 RNA-seq共获得758,574,050条读数，91.6%唯一比对到埃及伊蚊基因组。分析聚焦于表达呈阶梯式增加（LC₂₅ < LC₇₅-敏感 < LC₇₅-抗性）的转录本。

tRNA、电子传递链、CYP450主导高效氯氰氟菊酯压力相关的上调模式。 高效氯氰氟菊酯处理组共鉴定4,103个DEGs。在242个抗性相关基因中，仅24个（9.96%）符合递增表达模式，其中10个属于CYP450家族。HLR中上调最显著的基因包括三个tRNA（tRNA-Gly、tRNA-Ser、tRNA-Leu）、两个电子传递基因（COX8、ATP8）和一个核糖体RNA亚基（LSU rRNA），log2FC达6.04-10.6。基因本体（GO）富集分析鉴定出细胞粘附与信号、线粒体功能、翻译与蛋白质合成、转运与视觉、感觉感知等生物学过程。线粒体功能相关24个基因上调，其中COX2、COX3、ATP8等遵循递增模式。tRNA表达也遵循该模式。

CYP、OBP和表皮基因在高浓度氯氰菊酯抗性昆虫中上调。 氯氰菊酯处理组共鉴定2,865个DEGs。在HPR vs AF比较中，250个基因与抗性相关，其中156个与CYP450和表皮相关，38个与OBP相关。27个基因（10.8%）符合递增模式，其中16个为表皮基因。上调最显著的基因包括成虫表皮基因AAEL021930和AAEL025608（log2FC分别为6.8和6.07）。GO分析显示富集于能量产生与蛋白质加工、脂质代谢、免疫应答和几丁质代谢。部分几丁质代谢基因和OBP基因（OBP56a、OBP11、OBP21）遵循递增模式。

四、讨论与结论

讨论部分指出，AF品系在选择前已携带高频率的* kdr*等位基因（尤其F1534C近乎固定），构成预先存在的抗性基线，可能降低了代谢抗性基因的选择压力，这解释了为何各处理组内抗性与敏感个体间的表达差异不如预期大。高浓度选择品系中突变等位基因频率略低，可能与三重突变个体的生物学代价有关。氯氰菊酯高压选择显著增强MFO活性，而高效氯氰氟氰菊酯选择品系MFO水平低，表明不同杀虫剂类型诱导的解毒酶应答不同。GST活性在氯氰菊酯选择品系中升高，而在高效氯氰氟氰菊酯选择品系中与AF相当。

对于高效氯氰氟氰菊酯，其诱导的氧化应激可能激活Toll免疫通路，上调的半胱天冬酶（caspases）和NF-κB通路基因（REL1A、REL2）支持这一观点。上调的tRNA和线粒体相关基因（如SLIMP）提示代谢向维持稳态转变，可能与蚊虫肠道菌群互作有关。鞘磷脂磷酸二酯酶基因（AAEL006381）的上调和神经酰胺酶（AAEL007030）的下调提示神经酰胺水平变化可能影响抗性表型。

对于氯氰菊酯，上调的表皮基因和几丁质代谢基因提示表皮增厚或结构改变可减少杀虫剂渗透。OBPs可能作为分子陷阱隔离杀虫剂，防止其饱和神经元。CYP4家族基因的过表达与MFO活性增强一致，支持代谢解毒作用。这些机制随浓度升高而增强。

研究结论强调，尽管氯氰菊酯和高效氯氰氟氰菊酯共享作用模式，但在此埃及伊蚊种群中引发了截然不同的转录组应答：高效氯氰氟氰菊酯主要诱导线粒体功能、氧化应激防御和翻译相关基因，而氯氰菊酯主要诱导表皮、CYP450和OBP相关基因。转录组应答依赖于杀虫剂浓度，可能调节杀虫剂耐受性。该研究揭示了拟除虫菊酯抗性的复杂性，超越了经典机制，表明即使是低田间剂量也能选择应激耐受或物理防御策略。研究强调了在媒介控制规划中仔细选择拟除虫菊酯类型和剂量的重要性，以优化干预措施、延长其效力，并帮助研究人员建模抗性以保护社区。