术后鸟氨酸拉乌尔菌RO0725携带blaKPC-2、blaNDM-5及截短型mcr-10样元件的移动组相关多药耐药与宿主适应决定簇的基因组趋同研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Genomic convergence of mobilome-associated multidrug resistance and host-adaptation determinants in a postoperative Raoultella ornithinolytica isolate carrying blaKPC-2, blaNDM-5, and a truncated mcr-10-like element

　　

摘要专业翻译 目的： 通过整合基因组分析与表型验证，表征术后鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica）分离株RO0725中耐药决定簇、质粒介导传播与宿主适应的趋同特征，并进一步评估其临床风险与One Health风险。 方法： 采用长读长测序（long-read sequencing）生成完整基因组。后续分析评估了系统发育、平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）、耐药基因及质粒比较。表型验证包括接合试验（conjugation assay）、胆汁盐耐受性、生物膜形成及大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型。 结果： RO0725基因组包含一条染色体和五个环状质粒。RO0725携带14个抗菌药物耐药基因，分布于染色体和三个耐药相关质粒上。染色体决定簇包括内在耐药相关基因，如blaORN-1、oqxA10、oqxB9和fosA9。质粒pRO0725-1携带一个截短型mcr-10样元件，而pRO0725-2携带blaKPC-2、blaCTX-M-3、blaTEM-1、qnrS1、dfrA14、arr-3和aac(6′)-Ib-AKT。IncX3样质粒pRO0725-3携带blaNDM-5和ble-MBL。pRO0725-2和pRO0725-3在接合试验中均表现出可转移潜力。RO0725与任何公开分离株均未形成近克隆簇（定义为≤10个核心基因组单核苷酸多态性，core-genome SNPs）。RO0725含有参与黏附（ecp、fim和mrk）、铁获取（ent、fep、ybt、irp、fyuA和iutA）、应激反应（phoP、rcsB、rpoS、acrAB和ompA）及纤维素生物合成（bcs）的宿主适应相关决定簇。表型上，RO0725表现出增强的胆汁盐耐受性、弱生物膜形成能力，以及在大蜡螟模型中的中等致死率。 结论： RO0725代表了可转移多药耐药质粒与宿主适应决定簇的趋同。这些发现表明鸟氨酸拉乌尔菌既可作为机会性病原体，也可作为耐药基因跨物种传播的潜在储库。研究结果支持将其纳入医院及One Health抗菌药物耐药监测体系。

论文解读

一、研究背景与科学问题

碳青霉烯酶以及质粒介导的多黏菌素和替加环素耐药正在逐步限制肠杆菌目（Enterobacterales）感染的临床治疗选择。bla_KPC、bla_NDM、mcr及tmexCD-toprJ等耐药决定簇常定位于质粒、整合子及转座子相关区域，这些可移动位置促进了耐药基因在细菌物种和生态位之间的水平传播。近年来，bla_KPC、bla_NDM、mcr-10、tmexCD-toprJ和tet(X)已在鸟氨酸拉乌尔菌中被鉴定，提示该物种可能成为多药耐药决定簇的重要储库和传播载体。

鸟氨酸拉乌尔菌属于拉乌尔菌属（Raoultella），该属原归类于克雷伯菌属（Klebsiella）。该菌是一种有荚膜、兼性厌氧的革兰阴性杆菌，广泛分布于水生环境、土壤、食品、动物及医疗相关场所。由于其与产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）的表型相似性，常规方法可能将其误鉴定。该菌与血流感染、尿路感染、肺部感染、胆道感染、软组织感染及术后感染相关，尤其多见于免疫功能低下和接受侵入性操作的患者。从One Health视角看，来自临床病例、伴侣动物、河流沉积物和水产养殖废水的分离株携带耐药基因和可移动质粒，提示该物种可能参与耐药决定簇在人类、动物和环境之间的循环。

本研究针对一株从术后引流液中分离的鸟氨酸拉乌尔菌RO0725开展完整的基因组和表型表征。该菌株同时携带bla_KPC-2、bla_NDM-5和截短型mcr-10样元件，研究旨在评估其传播潜力和临床意义。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员对RO0725进行了全基因组测序、组装和注释。使用Oxford Nanopore PromethION平台进行长读长测序，采用Canu v2.2进行de novo组装，最终获得一条完整染色体和五个环状质粒。基因组注释使用Bakta v1.10.1，功能注释比对COG和KEGG数据库。耐药基因、毒力因子和质粒复制子分别使用ABRicate v1.4.0筛查CARD v4.0.1、ResFinder v4.7.2、VFDB和PlasmidFinder v3.0.3数据库。质粒移动性评估使用MOB-suite v3.1.9、oriTfinder和MacSyFinder v2.1.6。系统发育分析基于101株鸟氨酸拉乌尔菌基因组（含RO0725）的核心基因组SNP比对，使用IQ-TREE v3.1.3构建最大似然树。表型验证包括结晶紫法生物膜形成测定、胆汁盐耐受性评估和大蜡螟感染模型。接合试验以RO0725为供体菌，实验室保存的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）KP033为受体菌。

三、主要研究结果

3.1 临床经过与抗菌药物敏感性。 一例59岁男性Stanford A型主动脉夹层合并冠状动脉疾病患者于2026年1月6日接受升主动脉切除、人工血管置换和冠状动脉旁路移植术，术后于1月21日从引流液中分离出RO0725。RO0725对大多数β-内酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、妥布霉素和黏菌素耐药，对阿米卡星和诺氟沙星中介，对四环素类、替加环素和复方磺胺甲噁唑敏感。耐药表型与bla_KPC-2、bla_NDM-5、qnrS1和aac(6′)-Ib的存在基本一致，但dfrA14的检出与复方磺胺甲噁唑敏感性不一致。

3.2 基因组特征与功能注释。 Nanopore测序产生63,256条高质量读段，总计999.42 Mb。De novo组装获得六个完整环状复制子，总长5,878,252 bp，GC含量55.54%。染色体长5,526,141 bp，pRO0725-1至pRO0725-5长度分别为165,530、85,621、50,555、46,434和3,971 bp。共注释5,480个CDS、89个tRNA、25个rRNA、81个ncRNA和一个tmRNA，预测五个前噬菌体区域。检测到五个候选CRISPR阵列，但未发现相关cas基因。

3.3 系统发育位置与基因组相关性。 基于101株分离株构建的系统发育树由79,563个SNP和4,346个核心基因解析出六个主要分支。RO0725聚类于Clade IV，其最近亲缘为2021年在越南回收的环境分离株NUITM-VR1。RO0725与任何其他分离株均未形成近克隆簇（≤10个核心基因组SNP）。

3.4 耐药基因、毒力基因和质粒复制子的分布。 RO0725携带14个抗菌药物耐药基因，包括bla_CTX-M-3、bla_KPC-2、bla_NDM-5、bla_ORN-1、bla_TEM-1、aac(6′)-Ib-AKT、dfrA14、oqxA10、oqxB9、qnrS1、fosA9、arr-3、ble-MBL及截短型mcr-10样元件。该mcr-10样序列在比对区域具有100%核苷酸一致性，但仅覆盖全长参考序列的68.52%。RO0725是唯一同时携带bla_KPC-2、bla_NDM-5和mcr-10样元件的分离株。RO0725携带40个毒力相关基因，包括菌毛基因ecpA、fim、mrk及铁获取基因ent、fep、ybt、irp、fyuA、iutA。RO0725携带五种复制子类型：Col(pHAD28)、IncFIB(K)、IncFII(pKP91)、IncN和IncU，该组合在其他分离株中未观察到。

3.5 耐药质粒的比较分析。 pRO0725-1为165,530 bp的IncFIB(K)阳性F型大质粒，其骨架与CP193782.1最相似。该质粒携带截短型mcr-10样元件和13.4 kb纤维素生物合成相关位点（含bcsO、bcsQ、bcsA、bcsB、bcsG、bcsF及BcsC/BcsD/BcsZ样基因）。尽管预测具有完整接合装置，但未回收pRO0725-1阳性转接合子。pRO0725-2为85,621 bp的IncN/IncU多药耐药质粒，携带bla_KPC-2、bla_CTX-M-3、bla_TEM-1、qnrS1、dfrA14、arr-3和aac(6′)-Ib-AKT。该质粒以(6.3 ± 0.43) × 10^-3的平均频率转移至KP033。pRO0725-3为50,555 bp的IncX3样耐药质粒，携带bla_NDM-5-ble-MBL耐药模块，与CP094514.1具有100%查询覆盖率和99.97%核苷酸一致性，以(3.5 ± 2.1) × 10^-4的平均频率转移至KP033。

3.6 关键耐药决定簇的遗传背景与可转移性。 截短型mcr-10样元件嵌入含整合酶、重组酶、tnpA和ISEc27的移动遗传区域。pRO0725-2上的dfrA14存在于I类整合子相关结构中，排列为intI1-dfrA14-IS6100-IS1。约42 kb的多药耐药区域包含ISEc9-bla_CTX-M-3、bla_TEM-1、ISKpn27-bla_KPC-2、arr-3-aac(6′)-Ib-intI1和qnrS1模块。pRO0725-3上的bla_NDM-5邻近ble-MBL，位于含IS3000、ISAba125、IS5和转座酶相关元件的区域。

3.7 宿主适应与毒力相关表型。 暴露于50 mg/mL胆汁盐4小时后，RO0725的存活率为18.80% ± 0.56%，显著高于阴性对照W3110（4.10% ± 1.40%）和鸟氨酸拉乌尔菌ATCC 31898（14.47% ± 0.84%），但低于阳性对照PBIO1289（37.67% ± 1.19%）。结晶紫试验中RO0725的OD₅₇₀为0.355 ± 0.035，按Stepanovi?标准分类为弱生物膜产生菌。在大蜡螟模型中，1 × 10⁸和1 × 10⁷ CFU感染后72小时存活率分别为50%和80%，而NTUH-K2044在24小时内导致100%死亡。

四、讨论与结论

讨论部分指出，RO0725的定义性特征不是单一耐药决定簇的获得，而是多个耐药质粒与适应相关因素的趋同。不同质粒分别携带bla_KPC-2、bla_NDM-5和截短型mcr-10样元件，这些质粒与黏附、铁获取、应激耐受和纤维素生物合成相关决定簇共存，赋予RO0725广泛耐药表型、可转移耐药质粒和可测量的宿主适应能力。RO0725对碳青霉烯、头孢他啶-阿维巴坦和氨曲南-阿维巴坦均耐药，强调对共产不同碳青霉烯酶的分离株应遵循标准化药敏试验而非仅依赖基因型。RO0725的最近亲缘分离株来自越南、英国和西班牙，占据多样化生态位，但未形成近克隆簇，未提供近期直接传播的证据。pRO0725-2显示出最清晰的传播潜力，其IncN/IncU骨架整合了bla_KPC-2和I类整合子相关耐药模块。pRO0725-3与来自多种来源的IncX3样bla_NDM-5质粒高度同源，保留保守的IS3000-ISAba125-IS5-bla_NDM-5-ble-MBL核心结构。截短型mcr-10样元件仅覆盖全长参考基因的68.52%，可能源于移动化后的部分缺失或结构破坏，但RO0725的黏菌素耐药不能仅归因于该截短元件。pRO0725-1携带质粒相关纤维素生物合成位点，但其功能贡献未通过实验确定。表型分析表明RO0725不是典型高毒力菌株，其临床风险可能主要来自持续定植、治疗失败和向其他肠杆菌目转移耐药决定簇，而非极高的急性毒力。

研究结论为：术后鸟氨酸拉乌尔菌分离株RO0725携带含bla_KPC-2的IncN/IncU质粒和含bla_NDM-5的IncX3样质粒，同时携带截短型mcr-10样元件。RO0725表现出实验确认的耐药质粒可转移性和可测量的宿主适应表型。其主要风险是广泛耐药、持续定植和向其他肠杆菌目传播耐药基因的潜力。这些发现支持加强对这一新兴机会性病原体的临床和One Health监测。