《Frontiers in Pharmacology》：Berberine suppresses mechanical stretch-induced apoptosis and proliferation in vascular smooth muscle cells via ROS/PDI/Drp1 signaling pathway
编辑推荐：
研究背景：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）对机械牵张应力（stretch stress, SS）表现出异质性反应，部分细胞发生凋亡，部分细胞发生增殖。这种差异性命运决定的机制尚不清楚。目的：本研究探讨SS
研究背景：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）对机械牵张应力（stretch stress, SS）表现出异质性反应，部分细胞发生凋亡，部分细胞发生增殖。这种差异性命运决定的机制尚不清楚。目的：本研究探讨SS诱导的F-actin表达异质性是否决定不同的线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）反应，从而导致VSMCs命运差异，并评估小檗碱（berberine, BBR）的治疗潜力。方法：研究人员对VSMCs施加SS，表征F-actin异质性，检测mtROS、增殖和凋亡；使用药理学抑制剂和BBR检测PKCα/PDI/Drp1信号轴的作用。结果：SS在F-actin水平不同的VSMCs中诱导异质性mtROS产生；这种差异性ROS信号通过PKCα/PDI/Drp1轴同时激活促增殖mTOR/p70通路和促凋亡caspase-9/3级联反应。重要的是，BBR处理通过抑制PKCα激活及随后的线粒体信号，有效减弱SS诱导的增殖和凋亡。结论：研究结果揭示F-actin异质性通过驱动不同的线粒体ROS反应决定SS下VSMCs的命运；BBR通过拮抗这些ROS依赖性通路，有望成为治疗牵张相关血管病理（如高血压诱导的动脉粥样硬化）的策略。
高血压是动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）发生与进展的主要危险因素。高血压相关的病理性机械力可分为作用于血管内皮的剪切应力，以及垂直作用于血管壁的牵张应力（stretch stress, SS）。SS影响包括内皮细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）和外膜成纤维细胞在内的多个血管层。VSMCs是维持血管弹性、结构完整性和细胞间信号传导的关键细胞，其异常增殖和凋亡是AS起始与进展中的关键事件。然而，SS如何精确协调这两种相互对立的VSMCs命运仍不清楚。已有研究表明，SS能诱导VSMCs产生异质性活性氧（reactive oxygen species, ROS），且与F-actin表达水平相关。线粒体是细胞ROS产生的主要场所，蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）可通过与线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, Drp1）相互作用调节线粒体分裂，进而影响线粒体ROS产生和下游信号通路。PKCα也被认为参与维持增殖与凋亡的平衡。基于此，研究人员假设SS通过PKCα/PDI/Drp1轴在F-actin异质性表达的VSMCs中引起差异性线粒体ROS产生，从而同时促进增殖与凋亡，而小檗碱（berberine, BBR）可减轻这些效应。该研究为高血压诱导的血管重塑机制提供了新的见解，并识别了潜在的防治靶点。
研究人员从小鼠主动脉组织分离原代VSMCs，使用Flexcell FX-3000牵张系统施加周期性机械牵张；通过活细胞荧光共染检测F-actin异质性、总ROS及线粒体ROS（MitoSOX）和线粒体膜电位（JC-1）；采用免疫荧光和Western blot检测相关蛋白表达及磷酸化水平；使用PKCα抑制剂Go6976、PDI抑制剂bacitracin、mTOR抑制剂3-MA、线粒体ROS清除剂MitoTEMPO以及Drp1 siRNA干预，验证PKCα/PDI/Drp1信号通路的上下游关系及BBR的抑制作用。
4.1 BBR抑制了SS诱导的VSMCs增殖与凋亡
免疫荧光共染F-actin、Ki67和cleaved caspase-3显示，BBR显著抑制SS诱导的VSMCs增殖和凋亡。在SS条件下，cleaved caspase-3表达与高F-actin水平正相关，提示高F-actin细胞倾向于凋亡；而低F-actin表达的VSMCs表现出更高的Ki67阳性率，提示其增殖增强。这表明VSMCs内在的细胞异质性决定了其在SS下趋向增殖或凋亡的命运。
4.2 F-actin表达不同的VSMCs对SS刺激反应不同
SS显著增加VSMCs总ROS和线粒体ROS水平，BBR可降低ROS产生，作用类似于线粒体ROS清除剂MitoTEMPO。高F-actin表达的VSMCs在SS后显示清晰排列的肌丝结构和较强荧光强度，而低F-actin表达的VSMCs主要表现为肌动蛋白单体分布，ROS水平较低。JC-1检测显示，线粒体去极化模式与ROS产生水平一致，说明SS可引起线粒体功能障碍。
4.3 BBR抑制了SS诱导的VSMCs中PDI和Drp1共激活
PKCα抑制剂Go6976和BBR均可抑制PDI氧化和Drp1磷酸化，并减少SS诱导的PDI与Drp1活化。免疫荧光显示PDI与Drp1在VSMCs胞质中共定位，且其分布模式与F-actin表达一致，进一步支持VSMCs的功能异质性。
4.4 BBR抑制了SS诱导的PKCα/mTOR/p70及caspase-9/caspase-3信号通路激活
SS以时间依赖性方式显著激活增殖相关的mTOR/p70通路和凋亡相关的caspase-9/caspase-3通路，分别在30分钟和16小时达到峰值。BBR能有效抑制这两条通路的激活。SS还显著增加PKCα磷酸化，结合前述结果提示SS可能通过PKCα信号共激活PDI和Drp1。
4.5 PKCα介导了BBR对SS诱导的PDI/Drp1信号通路的作用
PDI抑制剂bacitracin可显著降低SS诱导的Drp1、mTOR和p70磷酸化，但不影响PKCα磷酸化；Drp1 siRNA敲低可降低mTOR和p70磷酸化，但不影响PKCα和PDI活化。这表明PKCα位于PDI上游，Drp1位于PKCα/PDI下游并调节mTOR/p70信号。BBR通过多靶点抑制该通路而抑制VSMCs增殖。此外，PKCα还介导SS条件下caspase-9/caspase-3凋亡通路的激活。
4.6 PKCα调节SS诱导的PDI/mTOR/caspase-9/caspase-3信号通路
mTOR抑制剂3-MA不影响SS诱导的PKCα/PDI/Drp1通路激活，也不抑制caspase-9/caspase-3通路激活，说明该凋亡通路不依赖mTOR信号。相比之下，PDI抑制剂bacitracin显著降低SS诱导的caspase-9和caspase-3激活，表明PDI位于凋亡信号级联上游。
4.7 mTOR介导SS诱导的增殖，而Drp1调节增殖与凋亡
mTOR抑制剂和PDI抑制剂均显著抑制SS诱导的VSMCs增殖。Drp1 siRNA敲低显著降低SS诱导的cleaved caspase-9和cleaved caspase-3水平，并减少增殖和凋亡细胞群。这表明mTOR主要介导SS诱导的增殖，而Drp1在SS反应中同时调节增殖与凋亡。
在讨论部分，研究人员将F-actin表达、ROS产生、线粒体功能和细胞命运决定联系起来，为VSMCs异质性提供了直接证据。结果显示，SS诱导的高F-actin VSMCs中ROS积累更多，线粒体膜电位去极化更明显，提示线粒体功能障碍。PDI作为Drp1的上游调节因子，其表达模式与F-actin水平一致，提示细胞骨架动态可能通过调节PDI活性影响线粒体功能。SS通过PKCα/PDI/Drp1/mTOR/p70通路促进增殖，并通过增加线粒体ROS和激活caspase-9/caspase-3通路诱导凋亡。BBR可抑制PKCα/PDI/Drp1信号通路并减少mtROS，从而对增殖和凋亡机制产生双重抑制。这些结果强调了BBR在调节机械应力诱导的血管重塑中的潜在价值，但研究人员也指出，仍需体内模型、药代动力学评估、剂量优化及临床相关终点等进行验证。
结论：本研究显示，SS根据F-actin水平诱导VSMCs产生不同细胞反应。在高F-actin表达的VSMCs中，SS通过PDI/Drp1通路促进线粒体分裂，导致ROS过度产生、线粒体膜电位去极化，并激活PKCα/PDI/Drp1/caspase-9/caspase-3凋亡级联。相比之下，低F-actin水平的VSMCs表现出较低ROS水平，倾向于激活PKCα/PDI/Drp1/mTOR/p70通路以支持细胞生长。BBR能有效抑制异质性VSMCs群体中凋亡和增殖信号通路。这些结果为高血压中机械应力诱导的血管重塑机制提供了新见解，并确定了AS及相关血管疾病可能的治疗靶点。未来应结合先进的活细胞超分辨成像和基因编码ROS生物传感器，实时捕捉F-actin重塑、Drp1介导的分裂及mtROS爆发的单细胞时空动态，从而建立细胞骨架异质性与命运决定之间的因果联系。
