《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Multimodal profiling uncovers an aging-associated ETS1-MYO1B vascular niche responsive to ipragliflozin
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背景：组织衰老涉及血管、免疫和基质等多个区室的复杂变化，这些变化共同重塑局部组织生态系统，并可能促进与年龄相关的疾病，包括癌症、纤维化疾病和心血管疾病。然而，衰老过程中是否会出现可重复的、细胞特异性的血管微环境状态，以及这些状态能否成为治疗靶点，目前尚不清楚。
背景：组织衰老涉及血管、免疫和基质等多个区室的复杂变化，这些变化共同重塑局部组织生态系统，并可能促进与年龄相关的疾病，包括癌症、纤维化疾病和心血管疾病。然而，衰老过程中是否会出现可重复的、细胞特异性的血管微环境状态，以及这些状态能否成为治疗靶点，目前尚不清楚。
方法：研究人员利用三个已发表的人体皮肤单细胞转录组数据集，构建了一个机器学习单细胞年龄时钟模型，并通过实际年龄进行验证。通过非负矩阵分解（NMF）聚类和扩散伪时间分析解析了血管亚群。这些发现进一步在15例人体皮肤样本中通过苏木精-伊红（H&E）染色数字图像分析和免疫组织化学进行了验证。利用炎症性人微血管内皮细胞系（HMEC-1）模型进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、流式细胞术、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、小干扰RNA（siRNA）敲低和染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。采用基于结构的美国食品药品监督管理局（FDA）药物库虚拟筛选、分子动力学模拟和生物层干涉测量法来识别并验证靶向ETS1的化合物。在D-半乳糖诱导的衰老模型中，通过口服伊格列净评估其体内疗效。
结果：预测年龄与实际年龄相关，其中血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞和周细胞携带最强的衰老信号。衰老皮肤表现出更高的低苏木素区域负荷、降低的边界复杂性变异和降低的血管面积异质性。研究人员鉴定出一个以MYO1B为标志的衰老相关周细胞亚群，同时发现了一个连续的内皮-周细胞转化（EndoPT）过程。转化生长因子-β1（TGF-β1）/白细胞介素-1β（IL-1β）刺激诱导HMEC-1细胞发生MYO1B和血小板衍生生长因子受体β（PDGFRB）阳性的周细胞样转化和衰老。ETS1结合MYO1B启动子并与衰老状态相关。伊格列净结合ETS1的转录调控区域，抑制ETS1-MYO1B轴，减少体外EndoPT和衰老，并在衰老大鼠皮肤中恢复表皮厚度，同时降低MYO1B、PDGFRB和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达。
结论：多模态图谱鉴定出一个衰老相关的ETS1-MYO1B血管微环境，其特征为高度炎症、内皮-周细胞可塑性和细胞衰老，并证明该微环境可被伊格列净治疗性靶向。由于这些过程也参与在癌症及其他年龄相关疾病中观察到的微环境重塑，因此该微环境可能为理解血管和基质改变如何塑造组织衰老和疾病易感性提供更广泛的见解。
研究背景与科学问题
皮肤衰老是一个涉及表皮变薄、真皮胶原蛋白重塑和丢失、修复能力下降的结构性与细胞性过程。衰老细胞积累并呈现衰老相关分泌表型（SASP），释放促炎细胞因子和基质降解酶，维持低度炎症和基质破坏。尽管单细胞研究已描绘出多种皮肤细胞群体随年龄的变化，但由于衰老同时发生在多种细胞类型中，解析特定细胞状态转变及其在衰老中的时序作用仍具挑战性。年龄关联模型虽能量化分子变化与年龄的关系，但无法建立因果关系，需实验验证。真皮微血管系统是皮肤微环境的关键组成部分，其功能随年龄下降，而内皮细胞固有的可塑性——特别是内皮-间充质转化（EndoMT）——被认为是微血管失稳的关键驱动因素。然而，一种替代性的血管谱系转变，即内皮-周细胞转化（EndoPT），在慢性衰老相关微环境应激中是否持续存在尚不明确。现有抗衰老干预主要针对清除衰老细胞、抑制SASP或调节mTOR/AMPK/NAD+通路，而针对深层组织微环境（尤其是真皮血管微环境、内皮-周细胞相互作用及微血管稳定性）的干预研究有限。因此，本研究旨在结合单细胞年龄时钟模型、组织学样本、体外炎症模型和体内衰老模型，聚焦于皮肤衰老过程中真皮血管微环境的变化。
研究方法与技术路线
研究人员首先整合了三个已发表的人体皮肤单细胞转录组数据集（Zou et al., 2021; Solé-Boldo et al., 2020; Reynolds et al., 2021），利用scVI校正批次效应后，构建基于伪批量表达矩阵的机器学习年龄预测模型，通过网格搜索优化超参数。对血管相关细胞群（血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞和周细胞）进行共识非负矩阵分解（cNMF）聚类和扩散伪时间分析。在15例人体皮肤样本（来自中国医科大学附属盛京医院）中进行H&E染色数字图像分析和免疫组织化学（IHC）验证。体外采用TGF-β1/IL-1β刺激HMEC-1细胞建立炎症模型，运用RT-qPCR、流式细胞术、SA-β-gal染色、siRNA敲低和ChIP-qPCR探究ETS1与MYO1B的调控关系。通过基于结构的FDA药物库虚拟筛选（AutoDock Vina）、分子动力学模拟（OpenMM）和生物层干涉测量法（BLI/OCTET）鉴定靶向ETS1的小分子。最后在D-半乳糖诱导的大鼠皮肤衰老模型中，通过口服伊格列净评估体内疗效。
研究结果
3.1 血管微环境在单细胞皮肤年龄时钟模型中携带主要衰老信号
研究人员构建的年龄预测模型在三个数据集中均保持预测能力，预测年龄与实际年龄呈正相关（Pearson r=0.811, p=4.41×10-5, n=18）。按细胞类型分层后，淋巴管内皮细胞（LE）、血管内皮细胞（VE）和周细胞在多个数据集中反复成为正相关细胞类型。衰老相关分泌表型（SASP）基因在这些细胞类型的年轻与老年组间存在差异，年龄时钟加权基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集覆盖细胞衰老、炎症等通路。15例皮肤样本的H&E数字图像分析显示，老年样本低苏木素区域负荷更高、边界复杂性变异减小、血管面积异质性降低，支持单细胞水平的发现。
3.2 MYO1B与衰老相关周细胞衰老亚群相关
对VE、LE和周细胞进行NMF聚类后，在两个数据集中均鉴定出三个主要周细胞簇，其中簇3富集老年供体细胞。MYO1B被确定为两个数据集中衰老相关周细胞簇的共同候选标志物，其在老年相关簇和老年组中表达更显著。在局部皮肤样本中，老年样本显示出更强的MYO1B、p21和PAI-1免疫组化信号。
3.3 炎症刺激诱导MYO1B阳性内皮-周细胞样转化
VE与周细胞簇3的联合分析显示两者在UMAP空间上存在连续拓扑邻近性，提示可能的状态过渡。扩散伪时间分析揭示了连续的转录组连续体，周细胞、内皮、衰老、炎症和EndoMT相关标志物（PDGFRB、CDH5、CDKN1A、ETS1、MYO1B、ICAM1、TGFBR2、ZEB2）在过渡区域呈空间异质性分布。体外实验中，TGF-β1/IL-1β联合处理增加了HMEC-1细胞中PDGFRB和MYO1B的mRNA和蛋白水平，同时诱导SA-β-gal阳性细胞增多、CD31表达降低，表明内皮-周细胞样转化与炎症性内皮衰老表型密切相关。
3.4 ETS1调控MYO1B表达并诱导细胞衰老
转录因子活性与MYO1B表达的相关性分析将ETS1确定为候选上游因子。虚拟敲除ETS1后，衰老和EndoMT相关基因（包括MYO1B、CCL2、COL6A3、B2M、CNN1）出现显著差异调控。年龄时钟模型的森林图显示ETS家族基因（ETS1、ELF1、ERG）与衰老状态正相关。在TGF-β1/IL-1β条件下，siETS1敲低降低了MYO1B mRNA表达，ChIP-qPCR证实ETS1结合MYO1B启动子且刺激后富集增加，同时siETS1减少了SA-β-gal阳性染色。
3.5 鉴定伊格列净为ETS1-MYO1B轴的潜在调节剂
通过对FDA药物库进行虚拟筛选，伊格列净被列为排名前三的候选分子之一。分子动力学模拟显示，伊格列净与ETS1转录调控区域的局部口袋结构域结合稳定，关键热点残基包括GLN336、PRO334、GLN339、GLY328、THR330、ASN86、LEU90、ALA327、TYR329和SER332。生物层干涉测量法（BLI）证实了伊格列净与ETS1之间存在浓度依赖性结合。功能上，伊格列净处理显著下调了MYO1B mRNA表达，减少了ETS1在MYO1B启动子的富集，并降低了MYO1B蛋白水平。
3.6 伊格列净在体外和体内减轻皮肤衰老
在体外，伊格列净处理降低了TGF-β1/IL-1β刺激下HMEC-1细胞的PDGFRB表达、SA-β-gal阳性细胞比例以及CDKN1A/p21和SERPINE1/PAI-1的mRNA水平。在D-半乳糖诱导的大鼠皮肤衰老模型中，伊格列净口服给药显著恢复了表皮厚度，并减少了血管周围区域MYO1B、PDGFRB和PAI-1的表达。
讨论与结论
本研究发现皮肤血管微环境是衰老相关特征的关键组分，与EndoPT紧密相连。单细胞年龄时钟模型识别出衰老和炎症程序在血管内皮和血管周围群体中富集，并发现以MYO1B为标志的衰老相关周细胞亚群。轨迹分析描绘了从内皮状态到周细胞样表型的渐进转化，且ETS1作为关键转录因子连接慢性炎症与EndoPT，直接结合MYO1B启动子驱动该炎症性衰老表型。伊格列净作为一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂，最初用于降血糖，但其心血管和肾脏保护作用提示存在独立于降糖的多效性。本研究将其拓展至抗衰老领域，证明伊格列净可通过抑制ETS1-MYO1B轴，在正常血糖条件下逆转衰老周细胞样表型，发挥局部血管保护作用。研究局限性包括：单细胞数据集有限限制外部验证；标准组织学难以在组织层面分辨EndoPT；伊格列净的确切分子结合位点和在衰老组织中的药代动力学仍需进一步验证。结论：本研究建立了皮肤衰老过程中慢性微血管炎症、细胞衰老和血管壁细胞可塑性之间的直接联系，通过表征EndoPT，揭示了血管微环境在衰老退化过程中的渐进状态转变，并为未来血管微环境衰老研究提供了转化策略。
