内质网应激选择获得氟康唑耐药与卡泊芬净耐受的耳念珠菌幸存者

《Frontiers in Microbiology》：ER stress selects for Candida auris survivors with acquired fluconazole resistance and caspofungin tolerance

　　

摘要：暴露于内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激可推动病原真菌出现抗真菌药物耐药性，但其潜在机制仍知之甚少。本研究表明，用ER应激诱导剂衣霉素（tunicamycin, TUN）处理耳念珠菌（Candida auris）B12037（进化枝3），可选择出获得性氟康唑耐药且部分菌株对卡泊芬净产生耐受的幸存者。药理学抑制实验揭示，卡泊芬净耐受依赖Hsp90-钙调磷酸酶轴，而氟康唑耐药则不依赖该通路。对暴露于衣霉素的亲本菌株进行RNA-seq分析，发现一种协调的应激反应，其特征为细胞壁生物合成、跨膜转运和自噬上调，同时翻译和能量代谢整体性抑制。在耐药幸存者中，氟康唑耐药与外排泵MDR1上调相关，其中分离株#10还表现出ERG11过表达。分离株#10的卡泊芬净耐受与多个几丁质合酶基因（CHS1、CHS3、CHS5）上调相关，提示几丁质介导的细胞壁重塑。分离株#19则呈现出不同的模式，提示存在卡泊芬净耐受的其他替代机制。这些发现揭示，ER应激通过不同分子途径选择出具有不同抗真菌耐药谱的耳念珠菌幸存者，凸显了该重要病原体在应激诱导下演化出多药耐药的可能性。

**论文解读：内质网应激驱动耳念珠菌获得氟康唑耐药与卡泊芬净耐受的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

耳念珠菌（*Candida auris*）自2009年首次报道以来，已成为全球重大公共卫生威胁。该病原体具有高效皮肤定殖、环境持久存活及人际传播等特征，已在六大洲引发多起院内暴发感染，血流感染死亡率超过40%。美国疾病控制与预防中心（CDC）将其列为“紧急抗菌耐药威胁”，世界卫生组织（WHO）将其列为“关键优先级”人类真菌病原体。耳念珠菌的多药耐药问题尤为严峻，不同进化枝的耐药谱存在显著差异，其中进化枝I、III和IV常表现为对氟康唑和两性霉素B等多药耐药。唑类耐药主要源于外排泵基因MDR1、CDR1过表达或靶基因ERG11点突变；棘白菌素耐药则与FKS1基因突变相关，但缺乏FKS突变的临床分离株也可通过增加几丁质合成等代偿性细胞壁重塑而降低棘白菌素敏感性。抗真菌耐药（resistance）与耐受（tolerance）是两种临床相关但机制不同的表型：耐药以最低抑菌浓度（MIC）升高为特征，而耐受表现为药物敏感菌株在抑制浓度下缓慢生长，常与持续念珠菌血症相关。既往研究表明，内质网（ER）应激通过未折叠蛋白反应（UPR）可调节多种病原真菌的药物敏感性：在白色念珠菌中，衣霉素（TUN）诱导2号染色体三体，赋予对卡泊芬净的交叉耐受；在新生隐球菌中，TUN或布雷菲德菌素A诱导非整倍体形成，导致氟康唑和5-氟胞嘧啶交叉耐药；在光滑念珠菌中，TUN应激驱动线粒体功能障碍和C染色体非整倍体两种适应策略。然而，ER应激是否影响耳念珠菌耐药性的出现此前尚无报道。鉴于耳念珠菌强大的多药耐药能力及UPR在整合应激信号与细胞壁完整性、外排泵调控中的核心作用，研究人员假设ER应激暴露可选择出对氟康唑和卡泊芬净敏感性改变的幸存者，并对此进行了系统研究。

**二、研究设计与主要技术方法**

研究人员以耳念珠菌进化枝III临床分离株B12037为亲本菌株，将约1×10?个细胞涂布于含不同浓度TUN（2–16 μg/mL）的YPD琼脂平板上，30°C培养5天后获得有限数量的幸存菌落。对幸存者进行斑点试验、纸片扩散试验（DDA）和肉汤微量稀释法测定氟康唑与卡泊芬净的敏感性表型；使用Hsp90抑制剂NVP-HSP990和钙调磷酸酶抑制剂环孢素A（CsA）进行药理学抑制实验。转录组分析采用RNA-seq技术，对TUN处理3小时的亲本菌株及三株幸存者进行差异基因表达分析，并结合Gene Ontology（GO）富集分析。功能验证实验包括罗丹明6G（R6G）外排试验和尼罗红外排试验以评估外排泵活性，以及通过酸水解-氨基葡萄糖比色法定量细胞壁几丁质含量。全基因组测序用于检测染色体拷贝数变异和点突变。

**三、主要研究结果**

1. **TUN暴露选择出耐药幸存者**：斑点试验显示，2 μg/mL TUN即抑制亲本菌株生长，≥4 μg/mL完全抑制。将约1×10?个B12037细胞涂布于含TUN平板上培养5天后，4 μg/mL和8 μg/mL TUN平板上出现有限数目的菌落。从4 μg/mL平板随机选取27个、8 μg/mL平板选取9个克隆进行斑点试验，其中分别有10个和6个克隆表现出TUN耐药，能够在完全抑制亲本菌株的浓度下生长。

2. **部分幸存者获得氟康唑耐药和/或卡泊芬净耐受**：在16株TUN耐药幸存者中，3株（#10、#16、#19）呈现氟康唑耐药，纸片扩散试验中抑菌圈完全消失，肉汤微量稀释法显示其氟康唑MIC均>128 μg/mL（亲本菌株为32 μg/mL）。其中#10和#19在卡泊芬净纸片周围抑菌圈内出现可见菌落生长（“雾状生长”），提示对卡泊芬净产生耐受，而其卡泊芬净MIC并未显著升高（亲本为0.5 μg/mL），符合耐受“拖尾生长”特征；#16则对卡泊芬净保持敏感。

3. **获得性卡泊芬净耐受依赖Hsp90和钙调磷酸酶**：在纸片扩散试验中，添加Hsp90抑制剂NVP-HSP990或钙调磷酸酶抑制剂CsA后，#10和#19的卡泊芬净抑菌圈内雾状生长被消除，形成与敏感对照相似的清晰抑菌圈边缘，表明两种蛋白均为卡泊芬净耐受表达所必需。相反，两种抑制剂均不能恢复#16的氟康唑敏感性，提示其氟康唑耐药机制不依赖Hsp90/钙调磷酸酶。

4. **TUN处理的转录组应答**：对亲本菌株进行4 μg/mL TUN处理3小时的RNA-seq分析显示，上调基因显著富集于细胞壁组织与生物合成（特别是β-葡聚糖生物合成过程，OR=19.91）、跨膜转运（OR=2.2，最显著）、自噬（OR=5.81）和钙介导信号传导（OR=19.81）；下调基因富集于翻译（OR=6.16）、ATP代谢过程（OR=7.46）、甾醇生物合成过程（OR=8.52）、氧化磷酸化（OR=7.1）和糖酵解过程（OR=34.89），呈现典型的UPR特征性全局翻译抑制和能量代谢重编程。

5. **幸存者中耐药相关基因表达谱**：三株幸存者均检测到外排泵基因MDR1上调，其中#10（log?FC=6.46）和#19（log?FC=7.65）上调最为显著，#16上调幅度较小（log?FC=1.17）。#10还表现出ERG11过表达（log?FC=1.86），提示其氟康唑耐药为外排增强与靶基因过表达的联合机制。CDR1表达在所有菌株中基本不变。卡泊芬净耐受菌株#10中多个几丁质合酶基因（CHS1、CHS3、CHS5）上调；#16（卡泊芬净敏感）缺乏几丁质合酶上调，反而几丁质酶基因CHT1上调（log?FC=1.23）；#19仅轻度上调CHS3和CHS5且下调CHT1（log?FC=?0.43），提示其耐受机制可能涉及几丁质重塑以外的途径。TUN靶基因ALG7在全部三株幸存者中均上调。

6. **功能验证外排活性与几丁质含量**：R6G外排试验显示三株耐药菌在40、60和80分钟时细胞外R6G累积均显著高于亲本菌株。由于R6G主要反映ABC型外排泵活性，研究人员进一步采用尼罗红外排试验，该染料已被验证为耳念珠菌Mdr1和Cdr1的底物。结果显示，亲本菌株在10分钟内尼罗红荧光保持约96.9%，而三株幸存者荧光分别降至63.7%、63.5%和66.4%，证实Mdr1相关外排活性增强。几丁质含量测定显示，#10（8.35%）和#19（8.08%）的细胞壁几丁质含量显著高于亲本（6.54%），而#16（6.42%）与亲本无显著差异，表明卡泊芬净耐受与几丁质介导的细胞壁重塑相关。

7. **全基因组测序揭示节段性非整倍体**：拷贝数分析显示，#16保持整倍体，提示其氟康唑耐药主要由转录重编程驱动而无大尺度基因组重排。相反，卡泊芬净耐受菌株#10和#19均携带节段性非整倍体：5号支架的节段性二体及6号支架上2–3拷贝的节段性区域。IGV分析未在TAC1b、CDR1、MDR1、ERG11、UPC2、FKS1、FKS2、CHT1等经典耐药基因中检测到点突变或小插入缺失。值得注意的是，MDR1的正向转录调节因子TAC1b并不位于5号支架的扩增区域内，且所有幸存者均未检测到TAC1b功能获得性突变，CDR1也未上调，提示这些菌株的氟康唑耐药走的是TAC1b非依赖途径，以Mdr1外排为驱动力。ALG7位于6号支架扩增区域，其拷贝数增加可能直接补偿TUN对靶酶的抑制。

**四、讨论与结论总结**

讨论部分指出，本研究表明ER应激可通过两种截然不同的适应策略驱动耳念珠菌耐药性出现：一是在整倍体背景下单纯转录适应（#16，MDR1上调介导氟康唑耐药）；二是通过节段性非整倍体实现转录与基因组重排的联合适应（#10和#19，同时获得氟康唑耐药与卡泊芬净耐受）。与既往报道的整条染色体非整倍体（如白色念珠菌2号染色体三体、隐球菌多条染色体非整倍体）不同，耳念珠菌中观察到的是节段性非整倍体，这种更精细的基因组改变可能以较低适应成本提供基因剂量优势。卡泊芬净耐受对Hsp90和钙调磷酸酶的依赖性，与Hsp90-钙调磷酸酶轴在真菌应激适应和药物耐受中的保守作用一致。研究存在的局限包括仅使用单一进化枝III分离株，其他进化枝是否采用类似机制需进一步研究。研究结论为：TUN诱导的ER应激选择出获得氟康唑耐药和卡泊芬净耐受的耳念珠菌幸存者，氟康唑耐药与MDR1上调和Mdr1相关外排增强相关，卡泊芬净耐受依赖Hsp90-钙调磷酸酶轴及几丁质重塑，这些发现强调了耳念珠菌通过应激适应获得临床重要抗真菌药交叉耐药的能力，提示针对适应性通路以预防耐药性出现的治疗策略具有重要意义。