微生物处理（干酪乳杆菌、酿酒酵母与植物乳杆菌）对蓝莓果实品质、根际土壤理化性质及细菌群落的影响

《Frontiers in Microbiology》：Effects of a microbial treatment of Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, and Lactobacillus plantarum on blueberry fruit quality, rhizosphere soil properties, and bacterial communities

　　

摘要专业翻译 引言： 微生物改良剂在可持续作物生产中应用日益广泛，但其施用是否伴随蓝莓栽培中果实性状、根际土壤条件及常驻细菌群落的协同变化，目前尚不明确。本研究考察了微生物培养处理是否与蓝莓果实表现、根际土壤化学性质及细菌群落特征的同步变化相关联。 方法： 将未接受微生物处理（NT）的高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum L. cv. Duke）植株，与通过滴灌接受由干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）组成的微生物培养处理（BT）的植株进行比较。研究人员评估了坐果日期和可溶性固形物含量（SSC），同时基于全长16S rRNA基因测序评估了采收期根际土壤化学性质、细菌群落特征，并进行了探索性的细菌功能潜力预测。 结果： 与NT相比，BT处理首次可见坐果提前10.89天，可溶性固形物含量更高，从11.33 ± 1.00 °Brix提升至15.00 ± 0.71 °Brix。BT处理与较低的电导率（EC）、阳离子交换量（CEC）、全氮（T-N）、铵态氮（NH?+–N）、交换性钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）及有机质（OM）相关，而有效磷（A-P）则更高。土壤pH、交换性钠（Na）、盐度和硝态氮（NO??–N）在处理间无显著差异。Bray–Curtis分析提示细菌群落存在与处理相关的聚类；然而，PERMANOVA未检测到整体群落组成存在统计学显著差异（pseudo-F = 1.464，R2 = 0.268，p = 0.100）。在处理响应的细菌序列特征子集中，BT表现出更高的观测丰富度和多样性，探索性的分类学及预测MetaCyc通路分析识别出与处理相关的模式。 讨论： 微生物培养处理与蓝莓果实性状、根际养分条件及细菌群落特征的协同差异相关。然而，本设计无法在这些响应之间建立因果关系。由于培养物是在生长培养基中施用的，且未设置单独的无菌培养基对照，因此活微生物的效应无法与培养基来源组分的潜在效应区分开来。

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一、研究背景与科学问题

蓝莓（Vaccinium spp.）是全球经济价值日益增长的重要水果作物，其生产力与根区土壤的理化及生物学条件密切相关。蓝莓具有纤细、浅层的根系结构，适应酸性、排水良好的土壤，对土壤pH、盐度、养分有效性和微生物活性尤为敏感。维持良好的根际环境是蓝莓可持续生产的重要环节，因为它支撑养分有效性、微生物群落稳定性和植物–土壤互作。

根际细菌群落与土壤化学条件密切相关，并随植物基因型、栽培历史和管理措施而变化。变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和疣微菌门（Verrucomicrobia）是蓝莓相关土壤中常见的细菌类群。在土壤性质中，pH被广泛认为是细菌群落结构的重要相关因子，而EC、CEC、有机质、氮形态、有效磷和交换性阳离子也与细菌群落组成的变化相关。在蓝莓体系中，磷和氮的有效性尤为重要，因为它们与植物养分状况和根际细菌组成相关。

微生物处理和生物肥料策略已被作为支持土壤质量和可持续作物生产的生物学途径加以研究。有益微生物可通过养分有效性、有机质周转、植物信号传导及与土著微生物群落互作等一系列过程与植物–土壤系统相互作用。在蓝莓栽培中，施用有益细菌联合体与植物生长、果实品质和土壤养分条件的变化相关。然而，对微生物改良剂的响应具有情境依赖性，因为施用的微生物会与常驻微生物群落及土壤环境的理化特征相互作用。

尽管微生物改良剂在蓝莓生产中的关注度日益增加，但在同一栽培体系中，微生物培养处理后蓝莓果实性状的变化是否与根际土壤化学性质和细菌群落特征的可测量差异同时发生，仍不清楚。因此，本研究的核心科学问题是：微生物培养处理是否与蓝莓果实性状、根际土壤化学性质和细菌群落特征的协同差异相关。

二、研究设计与主要技术方法

本研究于2025年2月15日至6月25日在韩国江原道横城郡（37.4556° N, 128.0700° E）一个商业蓝莓农场的未加热塑料温室中进行，供试品种为北高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum L. cv. Duke）。实验设未处理对照（NT）和微生物处理（BT）两个处理。果实坐果日期和可溶性固形物含量（SSC）每处理9个独立生物学重复（n = 9）；根际土壤化学和细菌群落分析每处理3个独立生物学重复（n = 3），与果实测量的植株不同。

研究采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   微生物菌剂制备与滴灌施用：干酪乳杆菌和植物乳杆菌在MRS肉汤中培养，酿酒酵母在YPD肉汤中培养。干酪乳杆菌–酿酒酵母混合培养物总活菌浓度为1 × 10⁸ CFU mL^?1，植物乳杆菌独立调整为1 × 10⁹ CFU mL^?1。处理期间通过滴灌系统分次施用，混合培养物累计514 L，植物乳杆菌培养物累计156 L。NT处理不接受微生物培养物或相应培养基，且未设置无菌培养基对照。
2. 2.
   果实性状测定：坐果日期以处理后天数（DAT）记录至首次可见浆果形成；SSC使用便携式数字折光仪（PAL-1，ATAGO）从鲜榨果汁中测定。
3. 3.
   土壤化学分析：pH和盐度采用1:5水土比，EC采用1:1水土比；全氮采用凯氏定氮法；有效磷采用Lancaster提取法；交换性K、Ca、Mg、Na采用1 M醋酸铵提取后以ICP-OES定量；CEC采用醋酸铵饱和法；有机质采用丘林重铬酸钾氧化法；铵态氮和硝态氮采用2 M KCl提取后比色测定。
4. 4.
   全长16S rRNA基因测序：使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取根际土壤总DNA，以27F和1492R引物扩增V1–V9区，在PacBio Sequel IIe系统上进行单分子实时（SMRT）测序，生成高保真（HiFi）读长。
5. 5.
   生物信息学分析：使用fastp和mothur v1.48.0进行质量过滤、比对、筛选、预聚类（diffs = 2）和嵌合体去除；以RDP v18数据库进行分类学注释。群落分析使用vegan和phyloseq包，包括Mantel检验、PERMANOVA和典范对应分析（CCA）。
6. 6.
   功能预测：使用PICRUSt2 v2.5.1预测MetaCyc通路丰度，以探索细菌功能潜力。

三、研究结果

3.1 微生物处理对坐果日期和可溶性固形物含量的影响

微生物处理显著提前了蓝莓坐果。NT坐果日期为57.56 ± 1.33 DAT，BT为46.67 ± 2.06 DAT，BT较NT提前约10.89天（Welch's t-检验，t = 13.31，df = 13.70，p = 3.21 × 10^?9）。BT的SSC（15.00 ± 0.71 °Brix）显著高于NT（11.33 ± 1.00 °Brix），增加3.67 °Brix（t = ?8.98，df = 14.40，p = 2.78 × 10^?7）。其他植物生长相关性状未见明显差异。

3.2 不同处理下的土壤化学性质

与NT相比，BT处理的EC（1.57 ± 0.09 dS m^?1 vs 3.54 ± 0.08 dS m^?1，p < 0.001）、CEC（24.21 ± 0.83 vs 45.02 ± 1.62 cmolc kg^?1，p < 0.001）、T-N（0.28 ± 0.01% vs 0.68 ± 0.00%，p < 0.001）、NH?⁺–N（84.06 ± 14.01 vs 144.77 ± 29.16 mg kg^?1，p = 0.0314）、交换性K（0.13 ± 0.02 vs 0.37 ± 0.07 cmolc kg^?1，p = 0.0058）、Ca（9.85 ± 0.90 vs 21.30 ± 0.66 cmolc kg^?1，p < 0.001）、Mg（1.07 ± 0.11 vs 1.69 ± 0.08 cmolc kg^?1，p = 0.0016）和OM（11.38 ± 1.22% vs 28.04 ± 3.06%，p = 0.0009）均显著降低。相反，A-P在BT中显著升高（722.70 ± 118.28 vs 364.57 ± 14.50 mg kg^?1，p = 0.0065）。pH、交换性Na、盐度和NO?^?–N在处理间无显著差异。

3.3 土壤化学性质间的相关结构

Pearson相关分析显示，EC与CEC（r = 0.997）、T-N（r = 0.997）、Ca（r = 0.998）、Mg（r = 0.981）和OM（r = 0.983）呈强正相关。CEC与T-N（r = 0.993）、Ca（r = 0.990）、Mg（r = 0.969）和OM（r = 0.991）正相关。A-P则与EC（r = ?0.916）、CEC（r = ?0.911）、T-N（r = ?0.939）、Ca（r = ?0.904）、Mg（r = ?0.859）和OM（r = ?0.881）呈负相关。NO?^?–N与大多数土壤性质相关性较弱。由于样本量有限且未分离处理效应，这些相关被解释为探索性的处理相关共变模式。

3.4 基于16S rRNA测序的细菌群落结构

稀释曲线显示所有六个样本的细菌序列特征随测序深度增加而积累，但未完全达到渐近线。Bray–Curtis不相似性热图和层次聚类显示NT和BT样本之间存在明显的处理相关聚类模式；然而，PERMANOVA未检测到整体群落组成的统计学显著差异（pseudo-F = 1.464，R² = 0.268，p = 0.100）。在门水平上，变形菌门和酸杆菌门是两个处理中的优势类群。厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门、疣微菌门、微基因菌门（Microgenomates）、副杆菌门（Parcubacteria）、柔膜菌门（Tenericutes）、衣原体门（Chlamydiae）和候选糖杆菌门（Candidatus Saccharibacteria）在BT中平均相对丰度较高；而浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、latescibacteria、Ignavibacteriae等低丰度门在NT中较高。

3.5 处理响应细菌序列特征的多样性、分类组成与环境关联

在处理响应的细菌序列特征子集中，BT的观测丰富度、Shannon多样性和Simpson多样性均一致高于NT。CCA分析中，CCA1和CCA2分别占约束变异的61.42%和30.67%，前两轴合计92.09%。NT样本主要位于CCA1和CCA2正方向，BT样本向负方向分布。CEC和NH?⁺–N朝向CCA1和CCA2正方向，A-P强烈朝向CCA1负方向。门水平比较显示，酸杆菌门、放线菌门、未分类细菌、拟杆菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和疣微菌门在BT中平均相对丰度较高；硝化螺旋菌门、浮霉菌门和变形菌门在NT中较高。探索性Mantel分析识别出10个细菌门与土壤性质之间的38个名义显著关联（p ≤ 0.05），其中变形菌门与A-P的关联最强（r = 0.929），其次为厚壁菌门与Ca（r = 0.925）、硝化螺旋菌门与K（r = 0.921）及硝化螺旋菌门与NH?⁺–N（r = 0.914）。

3.6 细菌群落属水平处理相关丰度模式

属水平探索性分析识别出68个细菌属或未分类类群（隶属8个门）在NT和BT之间表现出名义处理相关丰度模式（Spearman相关，p < 0.05）。正Spearman相关系数表示在BT中相对丰度较高，负值表示在NT中较高。由于未进行多重检验校正，这些模式被解释为探索性的处理相关关联。

四、讨论与结论

讨论总结： 微生物培养处理与蓝莓果实性状、根际养分条件和细菌群落特征的协同差异相关。BT处理中果实提前坐果和SSC升高，伴随EC、CEC、T-N、NH?⁺–N、交换性K、Ca、Mg和OM降低以及A-P升高。细菌群落方面，虽然PERMANOVA未检测到整体群落组成的显著差异，但Bray–Curtis聚类、处理响应序列特征的多样性和分类组成以及预测功能潜力均表现出处理相关模式。然而，研究者明确指出，由于根际土壤性质和细菌群落在采收时评估，这些关系被解释为关联而非因果通路证据。此外，由于培养物在生长培养基中施用且未设置无菌培养基对照，活微生物的效应无法与培养基来源组分的潜在效应区分。Mantel和CCA分析因生物学重复有限，仅作为探索性评估。

研究结论： 微生物培养处理与蓝莓果实性状、根际土壤化学条件和细菌群落特征的协同差异相关。BT处理使首次可见坐果提前10.89天，SSC从11.33 ± 1.00提升至15.00 ± 0.71 °Brix。BT处理与较低的EC、CEC、T-N、NH?⁺–N、交换性K、Ca、Mg和OM以及较高的A-P相关。在处理响应的细菌序列特征子集中，BT表现出更高的观测丰富度和多样性。然而，本实验设计无法建立因果关系，且由于缺乏无菌培养基对照，无法区分活微生物与培养基成分的效应。