《Frontiers in Microbiology》：The diguanylate cyclase CrdA contributes to cell adhesion and gut colonization by switching motility and sessile state of Cronobacter malonaticus
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Cronobacter malonaticus是一种新兴的食源性病原体，对脆弱人群构成严重威胁。尽管普遍存在的第二信使环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）在细菌毒力中的作用已被确立，但在C. malonaticus中协调致病性的
Cronobacter malonaticus是一种新兴的食源性病原体，对脆弱人群构成严重威胁。尽管普遍存在的第二信使环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）在细菌毒力中的作用已被确立，但在C. malonaticus中协调致病性的特异性二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclases，DGCs）尚不清楚。在此，研究人员系统性地表征了C. malonaticus中的13个推定DGC，并鉴定出CrdA是一个关键的调控因子。研究人员证明，CrdA通过调节细胞内c-di-GMP水平，相互抑制游动运动并促进依赖纤维素的生物膜形成。功能和结构分析揭示，CrdA的N端跨膜结构域对其二聚化和酶活性至关重要。此外，CrdA增强细菌对肠道上皮细胞的粘附以及体内肠道定殖，其表达在宿主细胞接触时被诱导。机制上，CrdA部分通过c-di-GMP效应子YcgR抑制运动性，并以BcsA依赖的方式调节生物膜形成。总之，这项工作阐明了一条新的信号通路，其中CrdA整合环境信号以协调毒力相关的生活方式转换，增进了对Cronobacter致病性中c-di-GMP信号的理解，并突出了破坏食品系统中生物膜介导持久性的潜在靶点。
论文解读：CrdA通过c-di-GMP信号切换运动与静止状态，促进Cronobacter malonaticus的细胞粘附与肠道定殖
**研究背景与目的**：Cronobacter属是一类革兰氏阴性肠道病原菌，广泛分布于环境和食品中，其中Cronobacter malonaticus是临床分离率较高的物种，可导致新生儿和免疫低下人群发生败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎，临床感染死亡率高达40%–60%。Cronobacter具有耐高温、耐干燥和耐酸等特性，这可能与其生物膜形成能力密切相关。生物膜的形成依赖细菌的初始粘附与运动性，而第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）是调控细菌运动、生物膜和毒力的核心信号分子。尽管c-di-GMP在多种细菌毒力中的作用已被证实，但C. malonaticus中负责合成c-di-GMP的DGCs种类及调控机制尚不明确。为此，研究人员系统鉴定了C. malonaticus中的13个推定DGC，并深入解析了其中名为CrdA的DGC在细菌生活方式切换中的功能与机制。
**研究总体结论**：研究表明，CrdA通过调节细胞内c-di-GMP水平，相互抑制细菌游动运动并促进依赖纤维素的生物膜形成。CrdA的N端跨膜结构域对其二聚化和酶活性至关重要。CrdA能够增强细菌对肠道上皮细胞的粘附及体内肠道定殖，其表达在接触宿主细胞时被诱导。机制上，CrdA部分通过c-di-GMP效应子YcgR抑制运动性，并以BcsA依赖方式调节生物膜形成。该研究揭示了CrdA整合环境信号以协调毒力相关生活方式转换的新信号通路。
**主要关键技术方法**：研究人员基于C. malonaticus NWU01基因组（GenBank登录号：CP174132.1）构建了13个推定DGC基因过表达质粒，利用pCVD442自杀载体构建基因缺失突变体。采用游动平板测定运动性，结晶紫染色和激光共聚焦显微镜评估生物膜，刚果红平板和苯酚-硫酸法定性定量EPS，ELISA检测c-di-GMP水平。以HCT116细胞系进行粘附实验，用新生C57BL/6J小鼠建立体内肠道定殖模型。通过细菌双杂交系统检测蛋白互作，结合AlphaFold3预测和点突变验证关键残基；qRT-PCR分析基因转录。以上方法均按已发表方案实施。
**研究结果**：
*系统性分析编码GGDEF结构域蛋白的基因*：基因组分析发现13个预测的c-di-GMP合酶基因。过表达筛选表明，其中6个菌株游动运动性下降，5个菌株生物膜产量增加，5个菌株纤维素产量增加，6个菌株对HCT116细胞粘附增强。CrdA在多个表型中表现显著，因此被选为深入研究的对象。
*CrdA相互调节运动性和生物膜形成*：缺失crdA增强细菌游动运动性，回补crdA则抑制运动性；缺失crdA降低生物膜量和胞外多糖产量，回补crdA显著促进生物膜形成，激光共聚焦显微镜显示互补株生物膜厚度增大。
*DGC活性对CrdA调节生物膜和运动性至关重要*：ELISA检测显示ΔcrdA菌株细胞内c-di-GMP水平显著低于野生型；将GGDEF活性位点（G266A、G267A）突变后，CrdA丧失抑制运动性和促进纤维素产生的能力，证明DGC活性是CrdA功能所必需。
*CrdA的N端结构域对其二聚化和DGC活性关键*：AlphaFold3预测CrdA通过N端跨膜结构域的氨基酸残基对（Y135–E95、Y135–N153、R138–N153）及N端与C端残基相互作用形成同源二聚体；细菌双杂交验证N端缺失或关键残基突变会破坏二聚化，并使CrdA失去调节运动性和纤维素合成的能力。
*CrdA在转录和转录后水平调节运动性*：缺失ycgR部分解除CrdA对游动运动的抑制，但未检测到CrdA与YcgR的直接互作；缺失yajQ无效。qRT-PCR显示ΔcrdA菌株中鞭毛基因flhD、fliA和fliC转录水平升高，表明CrdA还在转录水平抑制鞭毛基因表达。
*CrdA以BcsA依赖方式促进EPS产生和生物膜形成*：在ΔbcsA背景中过表达crdA不能恢复EPS产生和生物膜形成，且CrdA与BcsA或BcsB无直接互作，提示CrdA可能通过整体升高c-di-GMP水平激活BcsA，而非直接结合。
*CrdA增强C. malonaticus的细胞粘附*：ΔcrdA突变株对HCT116细胞的粘附率约为野生型的43%，回补crdA后粘附能力恢复；同时，细菌粘附宿主细胞可显著诱导crdA表达，而对照基因crdI表达不变。
*CrdA影响体内肠道定殖能力*：新生小鼠经口灌胃感染后，ΔcrdA突变株肠道定殖量显著低于野生型，回补株恢复至野生型水平，证明CrdA促进体内肠道定殖。
*CrdA调节C. malonaticus毒力基因转录*：qRT-PCR显示，缺失crdA导致外膜蛋白基因ompA、ompC、ompX、ompR转录上调；宿主侵袭相关基因urvY、luxR、wzx转录下调；抗原合成基因flgJ、sodA上调而lpxB下调；应激反应调控基因rpoS、groES、cpxR上调。回补crdA后这些基因表达水平恢复，表明CrdA广泛调控毒力相关基因。
**总结讨论与结论**：该研究系统筛选了C. malonaticus中的推定DGC，发现CrdA和CrdB是此前功能未知的新DGC，并证实CrdA通过c-di-GMP信号协调运动性与生物膜形成。CrdA的N端跨膜结构域通过两种方式稳定二聚体，与已知DGC（如WspR、PleD）的激活机制既有相似性又具独特性。在运动调控方面，CrdA部分依赖YcgR进行转录后抑制，同时也能抑制鞭毛基因转录，提示尚存在其他效应子参与。在生物膜调控方面，CrdA依赖BcsA，但不直接与之结合，可能通过调控局部c-di-GMP池浓度激活纤维素合酶。结合crdA表达受宿主接触诱导的现象，研究人员提出如下模型：当C. malonaticus接触宿主细胞时，crdA表达被诱导，导致胞内c-di-GMP水平升高，抑制运动、促进EPS产生，使细菌从游动状态切换为静止状态，从而增强粘附和肠道定殖。研究结论：CrdA是C. malonaticus中一个关键的DGC，通过调控c-di-GMP稳态协调运动性、生物膜形成、细胞粘附与肠道定殖，其N端结构域对二聚化和酶活性必不可少；该工作拓展了对Cronobacter致病性中c-di-GMP信号的认识，并提示CrdA可作为破坏食品链中生物膜介导持续性感染的潜在药物靶点。
