《Frontiers in Toxicology》：Differential toxicity of water- and DMSO-extractable PM2.5 fractions in human alveolar organoids
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PM2.5是一种与多种疾病发生和加重相关的主要空气污染物。然而，由于缺乏合适的实验模型，PM2.5对机体的损害及其与疾病的关系仍知之甚少。本研究旨在利用人肺泡类器官（human alveolar organoids, hALOs）建立PM2.5毒性暴露模型，并
PM2.5是一种与多种疾病发生和加重相关的主要空气污染物。然而，由于缺乏合适的实验模型，PM2.5对机体的损害及其与疾病的关系仍知之甚少。本研究旨在利用人肺泡类器官（human alveolar organoids, hALOs）建立PM2.5毒性暴露模型，并探究PM2.5水提取组分（water-extractable fraction）与二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）提取组分（DMSO-extractable fraction）所致肺泡损伤的差异。结果表明，PM2.5以剂量和时间依赖方式诱导hALOs发生形态损伤，其中DMSO提取组分比水提取组分引起更严重的损伤。PM2.5诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高和细胞死亡与所观察到的形态损伤相关。在损伤过程中，研究人员还观察到类器官内AT2细胞数量持续下降，同时AT1细胞数量略有增加，提示可能存在AT2向AT1的转分化。本研究有助于推动体外3D类器官模型在毒理学研究中的应用，并促进PM2.5毒理学与病理学的深度融合。
论文解读
PM2.5（空气动力学直径≤2.5 μm）是吸入性暴露的主要空气污染物，经鼻腔、气管和细支气管进入肺泡后，可诱发哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）、特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）和肺癌等多种肺部疾病。PM2.5由无机、有机和微生物组分构成，其中金属、多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）、含碳颗粒（carbon-containing particles, CPs）等被认为毒性最强。然而，现有关于PM2.5肺损伤的研究多依赖二维细胞系和啮齿动物模型。二维模型缺乏组织结构与细胞-基质相互作用，难以模拟真实组织微环境中的细胞功能和信号动态；动物模型则存在种属差异、重复性差和难以实时监测等问题。类器官模型为毒理学研究提供了新方向，但基于类器官的PM2.5毒理学研究仍不足以阐明体外多细胞协同反应，尤其是PM2.5暴露后肺泡相关细胞群的动态变化。因此，研究人员在本研究中利用人肺泡类器官（hALOs）模型，系统比较PM2.5水提取组分与DMSO提取组分对肺泡的损伤差异，并观察AT1/AT2细胞的动态变化，为PM2.5毒性机制研究提供更接近人体的体外工具。
研究人员以人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）系H9为起点，经定型内胚层（definitive endoderm, DE）、前肠内胚层（anterior foregut endoderm, AFE）、腹侧前肠内胚层（ventral anterior foregut endoderm, VAFE）、芽尖祖细胞类器官（bud tip progenitor organoids, LPOs）等阶段，约35天诱导形成由AT1和AT2细胞为主的hALOs。PM2.5样品采自安徽省芜湖市皖南医学院滨江校区逸夫科技楼北区三楼平台（距地约10 m，中流量采样器流量100 L/min，连续采样66 h，使用2023年2月的石英纤维膜）；每张采样膜均分为两等份，分别用超纯水或DMSO超声/振荡提取40 min并经10 μm滤膜过滤，得到水提取组分（0–200 μg/mL）和DMSO提取组分（0–12.5 μg/mL）。主要技术方法包括免疫荧光染色、流式细胞术、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Annexin V/PI凋亡检测和DCFH-DA活性氧检测；实验中均使用至少3次独立分化的类器官，每个条件设至少3个复孔。
3.1 hALOs的构建与鉴定。研究人员在诱导分化前通过免疫荧光和流式细胞术验证hESCs-H9的多能性；在不同分化阶段采用形态学、免疫荧光和qRT-PCR监测标志基因表达。约35天后成功获得成熟hALOs，其中PDPN标记AT1细胞、Pro-SPC标记AT2细胞，证明模型构建成功。
3.2 PM2.5水提取组分与DMSO提取组分诱导的形态损伤。水提取组分暴露4天时hALOs形态无明显变化，7天开始出现颜色暗淡、边缘皱缩、中央管腔实化等损伤，且损伤比例随浓度升高而增加；12天时类器官严重皱缩并广泛粘连，无法计数。DMSO提取组分在4天即出现浓度依赖性形态改变，7天损伤比例进一步升高，12天损伤更为严重。在相同质量浓度（如0.5、2.5、12.5 μg/mL）下，DMSO提取组分诱导的形态损伤明显强于水提取组分。值得注意的是，0.2% DMSO溶剂对照也可导致5.3%的hALOs出现形态损伤，提示DMSO在三维类器官模型中可能被低估了细胞毒性。PM2.5暴露未显著影响存活类器官的平均直径。
3.3 PM2.5诱导的细胞死亡驱动hALOs形态转化。PI染色显示水提取组分和DMSO提取组分处理后类器官内出现明显红色荧光，表明细胞膜完整性丧失和死亡细胞存在。Annexin V/PI流式细胞术显示两种提取组分均诱导剂量依赖性凋亡，0.5 μg/mL时凋亡比例已有统计学显著差异；但两种提取组分的凋亡诱导水平无差异。结合PI染色结果，研究人员推测凋亡不是PM2.5引起类器官大量细胞死亡的主要原因，可能还有其他类型的细胞死亡参与。
3.4 PM2.5暴露与ROS水平升高相关。DCFH-DA荧光染色显示，水提取组分和DMSO提取组分均使hALOs内ROS水平升高。12.5 μg/mL DMSO提取组分的相对荧光强度强于200 μg/mL水提取组分；在二维A549细胞中也观察到DMSO提取组分在等质量浓度下比水提取组分诱导更强的ROS产生。这种ROS升高与细胞死亡和形态损伤一致，提示ROS升高与PM2.5所致hALOs损伤密切相关。
3.5 PM2.5暴露改变类器官细胞组成。通过免疫荧光、流式细胞术和qRT-PCR检测AT1标志物PDPN、HOPX以及AT2标志物Pro-SPC、SFTPC。结果显示，两种提取组分均剂量依赖性地降低AT1和AT2细胞比例，且DMSO提取组分作用更强。AT2细胞随暴露时间延长持续下降；暴露12天后，12.5 μg/mL提取组分处理组AT2细胞仅保留对照水平的22%。AT1细胞比例则在第4至7天明显下降后，在第12天显著回升，呈现V形趋势，提示在损伤过程中可能发生了AT2向AT1的转分化。
讨论部分指出，hESCs来源的hALOs比成体干细胞来源模型具有更高的多能性、无限增殖潜力以及长期培养的结构和遗传稳定性，更适合PM2.5毒性评估。DMSO提取组分中有机成分显著多于水提取组分，这可能是其毒性更强的主要原因。但DMSO本身在0.2%浓度下即可损伤hALOs，提示未来需考虑毒性更低的其他有机溶剂。对于AT1/AT2细胞比例变化，AT2细胞持续减少后AT1细胞恢复的现象与AT2向AT1转分化一致，但仅凭细胞丰度变化尚不能确证细胞谱系转化，未来需结合遗传谱系示踪实验加以验证。此外，hALOs模型缺乏免疫细胞和血管成分，且基于Matrigel的浸没培养无法完全模拟肺的液-气界面，因而不能重现PM2.5经全身炎症和神经内分泌通路引起的系统效应。尽管如此，hALOs仍是连接二维培养与动物实验的有力工具。
研究结论：总之，研究人员建立了基于hESCs来源肺类器官的PM2.5毒性暴露模型，实现了实时监测和多细胞相互作用分析。利用该模型证明，PM2.5的DMSO提取组分比水提取组分具有更强的细胞毒性，并可诱导更严重的类器官形态损伤。此外，两种PM2.5提取组分均降低AT1和AT2阳性细胞比例，提示AT1/AT2平衡发生改变，其中可能涉及AT2向AT1的转分化。
