《Frontiers in Plant Science》：Non-target-site resistance mechanisms to glyphosate in Eleusine indica from Xinjiang cotton fields
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草甘膦抗性在杂草中通常由5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的靶标位点变化介导，但非靶标抗性（NTSR）机制日益被认为是田间进化抗性的重要贡献因素。本研究鉴定了一个采集自中国新疆棉田的草甘膦抗性牛筋草（Eleusine indica）种群。整株剂量
草甘膦抗性在杂草中通常由5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的靶标位点变化介导，但非靶标抗性（NTSR）机制日益被认为是田间进化抗性的重要贡献因素。本研究鉴定了一个采集自中国新疆棉田的草甘膦抗性牛筋草（Eleusine indica）种群。整株剂量-响应分析表明，抗性种群GR-R的GR50值比敏感种群GR-S高3.36倍。GR-R在草甘膦处理后积累的莽草酸显著减少（在处理后24和48小时，约为GR-S的二分之一），表明莽草酸途径受到的影响降低。然而，对保守的EPSPS区域进行测序未发现已知抗性相关残基的替换，且EPSPS表达在GR-R与GR-S之间无显著差异。RNA-seq分析鉴定出364个差异表达基因，富集于氧化应激、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、激素信号转导及转运蛋白相关过程。四个与除草剂代谢抗性相关的上调基因——CYP94C1、ABCA7、ABCG37和ABCG39——已通过qPCR验证。结构建模和分子对接提示草甘膦与所编码蛋白之间存在潜在相互作用，其中ABCG39在ABC转运蛋白中显示出最强的预测结合能力。这些结果表明，GR-R的草甘膦抗性并非由常见的基于EPSPS的机制驱动，而是与涉及细胞色素P450和ABC转运蛋白候选基因的NTSR相关。本研究为牛筋草中P450和转运蛋白介导的草甘膦抗性的功能研究奠定了基础。
一、研究背景与问题
杂草是全球作物生产中最持久的生物性制约因素之一，与作物竞争光照、养分、水分和空间，造成严重产量损失并增加生产成本。在现代集约化农业中，化学除草因其高效、适用性广和劳动力需求相对较低而成为杂草管理的主要手段。然而，除草剂的重复和简化使用对杂草种群施加了强烈的选择压力，导致全球范围内除草剂抗性的快速进化。截至目前，全球至少已有548种杂草被报道进化出除草剂抗性。除草剂抗性机制一般分为靶标抗性（TSR）和非靶标抗性（NTSR）两类。TSR通常涉及靶标蛋白的点突变、靶标基因扩增或过表达；而NTSR涵盖更广泛且更复杂的过程，包括除草剂吸收减少、转运受损、代谢解毒增强、液泡或质外体隔离等。与TSR相比，NTSR通常由多基因控制，可能对不同作用机制的除草剂产生交互抗性，因此对抗性诊断和管理构成特别挑战。
草甘膦是全球使用最广泛的非选择性除草剂之一，其除草活性源于对莽草酸途径中芳香族氨基酸生物合成关键酶——5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的抑制。EPSPS受抑制导致莽草酸积累并破坏下游代谢过程，最终导致植株死亡。由于草甘膦的广谱活性和良好的农艺特性，其在果园、休耕地、非作物区域及抗草甘膦作物系统中被广泛使用。然而，高强度重复使用已导致众多杂草物种进化出草甘膦抗性。牛筋草（Eleusine indica）被认为是世界上最难防除的杂草之一。草甘膦抗性牛筋草最早在马来西亚报道，此后在世界多地包括中国均有记录。以往研究主要集中于TSR机制，如EPSPS点突变（Pro106替换及Thr102/Pro106双突变）以及EPSPS过表达和拷贝数变异，而NTSR则与P450基因（包括CYP71AK44）的过表达相关。然而，许多田间进化种群，特别是缺乏EPSPS突变或过表达的种群，其抗性分子基础仍不清楚。新疆是中国重要的棉花产区，草甘膦的重复使用可能对牛筋草施加强烈选择压力，但当地种群的抗性状况和潜在机制在很大程度上尚属未知。因此，本研究旨在系统鉴定新疆棉田牛筋草种群的草甘膦抗性水平并解析其分子机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员从新疆棉田采集了三个疑似草甘膦抗性牛筋草种群，并以从未接触过除草剂的荒地敏感种群GR-S为参照，开展了整株剂量-响应分析、莽草酸积累测定、EPSPS基因测序与表达分析、转录组测序（RNA-seq）、qPCR验证以及同源建模和分子对接等系列研究。结果表明，抗性种群GR-R的GR50值为564.91 g a.e. ha-1，抗性指数（RI）为3.36。GR-R在草甘膦处理后莽草酸积累量显著低于GR-S，表明其莽草酸途径受抑制程度较轻。EPSPS保守区域测序未发现已知抗性相关氨基酸替换（Ala100、Thr102、Pro106等位点均无突变），且EPSPS表达水平在抗感种群间无显著差异，排除了TSR机制。转录组分析鉴定出364个差异表达基因（DEGs），其中145个上调、219个下调，富集于氧化应激、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、激素信号转导及转运蛋白相关过程。进一步筛选出四个与除草剂代谢抗性相关的上调候选基因：CYP94C1（细胞色素P450家族）、ABCA7、ABCG37和ABCG39（ABC转运蛋白家族），均经qPCR独立验证。分子对接显示草甘膦与四种候选蛋白均存在热力学有利的相互作用（结合能-3.67至-4.52 kcal mol-1），其中ABCG39结合能最低（-4.52 kcal mol-1）且qPCR上调倍数最高（4.18倍），是最具潜力的功能验证候选基因。该研究首次系统揭示了新疆棉田牛筋草种群中不依赖EPSPS靶标机制的草甘膦抗性，为P450和ABC转运蛋白介导的NTSR机制研究奠定了重要基础，对理解田间杂草抗性进化多样性及制定抗性治理策略具有重要科学意义。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：从新疆棉田采集三个疑似抗性种群和一个荒地敏感参照种群GR-S的种子，在温室条件下进行整株剂量-响应分析以测定GR50值和抗性指数；采用莽草酸积累测定作为EPSPS抑制的生化指标；通过PCR扩增和Sanger测序检测EPSPS基因保守区域靶标位点突变；利用qPCR分析EPSPS及候选基因的相对表达水平；采用Illumina NovaSeq平台进行转录组测序（RNA-seq），通过DESeq2进行差异表达分析；利用SwissModel服务器进行同源建模，并使用AutoDock Tools进行半柔性分子对接分析草甘膦与候选蛋白的相互作用。
四、研究结果
4.1 田间采集的牛筋草种群表现出差异水平的草甘膦抗性
通过整株剂量-响应试验，研究人员比较了三个疑似抗性种群与敏感种群GR-S对草甘膦的响应。结果表明，所有种群均呈现剂量依赖性生长抑制，但抑制程度差异显著。GR-S在540 g a.e. ha-1及以上剂量下表现出严重生长抑制和植株死亡，而抗性种群保留了更大的地上部生长量，其中GR-R种群在推荐田间剂量下表现出最强的存活率和生物量保留。GR-S的GR50值为168.03 ± 1.76 g a.e. ha-1，三个疑似抗性种群的GR50值范围为257.72 ± 23.38至564.91 ± 35.65 g a.e. ha-1。GR-R种群的GR50值最高（564.91 ± 35.65 g a.e. ha-1），抗性指数为3.36，因此被选为后续研究对象。
4.2 莽草酸积累减少证实GR-R对草甘膦敏感性降低
研究人员在540 g a.e. ha-1草甘膦处理后0、24、48、72和96小时测定了GR-S和GR-R的莽草酸含量。处理前两种群莽草酸含量相似。处理后GR-S在24和48小时积累了大量莽草酸，而GR-R的积累量显著较低，接近基础水平。在24和48小时，GR-S的莽草酸积累量约为GR-R的两倍；72小时仍存在显著差异，但GR-S的积累已开始下降；96小时两种群含量再次相当。这些生化数据与整株剂量-响应结果一致，表明GR-R种群在草甘膦处理后受到的影响较小。
4.3 GR-R的草甘膦抗性与EPSPS靶标位点突变或过表达无关**
研究人员扩增并测序了包含已知草甘膦抗性相关氨基酸残基（Ala100、Thr102、Pro106等）的EPSPS基因保守区域。GR-S和GR-R的序列色谱图在扩增区域内完全一致，未检测到Ala100、Thr102或Pro106位点的氨基酸替换。qPCR分析显示EPSPS转录本丰度在两种群间无显著差异（P = 0.3299）。这些结果排除了靶标位点机制，提示非靶标机制可能参与了抗性表型。
4.4 转录组分析鉴定出参与NTSR的候选基因
RNA-seq数据显示高质量测序结果，每个文库获得20.66至21.07百万条干净读数，比对率达97.09%至98.32%。主成分分析显示GR-S和GR-R样本沿PC1（解释38.5%方差）部分分离。差异表达分析鉴定出364个DEGs，其中145个上调、219个下调。基因本体（GO）富集分析显示，富集的生物学过程包括过氧化氢分解代谢过程、碳水化合物代谢过程、色氨酸生物合成过程、氧化应激响应、脱落酸激活信号通路、天冬酰胺生物合成过程、细胞壁组织、辅酶A生物合成过程、木聚糖分解代谢过程和信号转导。分子功能层面富集了ATP结合、金属离子结合、血红素结合、水解酶活性、ABC型跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶相关活性等。进一步筛选DEGs中注释为P450、GST、GT、AKR和ABC转运蛋白的基因，鉴定出四个上调候选基因：Eindica.04G022553（注释为CYP94C1）、Eindica.06G029920（注释为ABCA7）、Eindica.04G020888（注释为ABCG37）和Eindica.02G011403（注释为ABCG39）。
4.5 qPCR验证确认GR-R中CYP94C1和ABC转运蛋白基因上调**
qPCR分析使用独立生物学样本验证了四个候选基因的表达。CYP94C1在RNA-seq中上调1.78倍、qPCR中上调1.85倍；ABCA7在RNA-seq中上调4.71倍、qPCR中上调2.87倍；ABCG37在RNA-seq中上调3.57倍、qPCR中上调2.88倍；ABCG39在RNA-seq中上调2.30倍、qPCR中上调4.18倍。四个基因在GR-R和GR-S之间的差异均达到显著水平（P < 0.05）。
4.6 结构建模和分子对接支持草甘膦与候选蛋白的潜在相互作用
研究人员为CYP94C1、ABCA7、ABCG37和ABCG39生成了三维结构模型，并进行了半柔性分子对接。草甘膦可 accommodated 在四种候选蛋白的预测结合口袋中，结合能为-3.67至-4.52 kcal mol-1。ABCA7的结合能为-3.67 kcal mol-1，草甘膦与Lys395和Glu706形成常规氢键。ABCG37的结合能为-3.78 kcal mol-1，Arg665和Thr779贡献常规氢键相互作用。ABCG39的结合能最低（-4.52 kcal mol-1），草甘膦与Ser194、Gly195、Lys196、Gln238和Glu353等残基相互作用，观察到多个氢键。CYP94C1的结合能为-4.03 kcal mol-1，草甘膦与Lys464和Asp465相互作用，周围有Ile462、Cys461、Val460、Leu466和Leu468等疏水残基环绕。
五、讨论与结论
讨论部分指出，GR-R种群的抗性水平相对于携带EPSPS突变、过表达或拷贝数扩增的高抗性种群属于中等水平，但中等抗性在农艺上仍具有重要意义，因为其允许植株在推荐田间剂量下存活并补充土壤种子库。在田间条件下，即使草甘膦敏感性的微小变化，在种群规模大、除草剂重复暴露、喷雾覆盖不均匀或胁迫条件下也可能损害防治效果。GR-R中莽草酸积累减少表明较少的草甘膦到达或抑制了体内的EPSPS，或下游生理响应存在差异。在缺乏EPSPS突变或过表达的情况下，这种模式与草甘膦向叶绿体递送减少、细胞内区室化改变、外排增强或其他NTSR相关过程一致。
转录组分析揭示的氧化应激、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、激素信号和细胞壁组织相关生物学过程与草甘膦引发的广泛生理扰动及NTSR的多因子性质一致。研究人员指出，该研究存在一个局限性：转录组比较是在单一抗性种群（GR-R）和单一敏感种群（GR-S）之间进行的，两者来自不同地理位置，因此部分DEGs可能反映种群特异性遗传背景或局部环境适应而非草甘膦抗性本身。
关于候选基因，CYP94C1属于CYP94家族，该家族主要参与脂肪酸和茉莉酸代谢，尤其是茉莉酰异亮氨酸的氧化周转。CYP94C1可能通过直接修饰草甘膦或草甘膦相关代谢物（基于分子对接结果），或通过调节脂质衍生信号、膜特性、氧化应激响应及茉莉酸相关通路来影响除草剂耐受性。ABC转运蛋白是另一类与NTSR相关的重要蛋白家族。ABCA7、ABCG37和ABCG39的显著上调提示转运蛋白介导的过程可能参与了该种群的草甘膦敏感性降低。其中ABCG39尤为值得关注，因为它同时表现出最强的qPCR验证上调（4.18倍）和ABC蛋白中最低的预测对接能量（-4.52 kcal mol-1）。ABCG亚家族成员通常与质膜转运相关，可参与输出特化代谢物、脂质和异生物质相关化合物。多个ABC转运蛋白基因的同时上调提示GR-R的草甘膦抗性可能涉及协调的转运响应而非单基因效应。
研究结论：本研究鉴定了一个来自新疆的草甘膦抗性牛筋草种群，其抗性与常见的EPSPS靶标位点突变或EPSPS过表达无关。转录组学、qPCR和对接分析突出CYP94C1和三个ABC转运蛋白基因作为抗性的候选贡献因子。这些发现拓宽了对牛筋草草甘膦抗性多样性的理解，并为P450和转运蛋白相关NTSR的机制研究奠定了基础。未来对这些候选基因的功能表征将对于确定它们是否直接介导草甘膦解毒或转运，或是否作为更广泛的胁迫适应网络的组成部分使抗性植株能够在草甘膦选择下存活，具有关键意义。
