基于SCAR分子标记鉴定支气管肺泡灌洗液样本中Fumigati组、A. flavus及A. niger的初步临床评价

《Frontiers in Tropical Diseases》：Preliminary clinical evaluation of SCAR-type molecular markers for the identification of the section Fumigati, A. flavus, and A. niger in bronchoalveolar lavage samples

　　

摘要翻译：

目的：本研究旨在开发并开展SCAR分子标记的初步临床评价，用于鉴定Fumigati组DNA、黄曲霉（A. flavus）和黑曲霉（A. niger）。

方法：采用RAPD-PCR方法从Fumigati组、A. flavus和A. niger的多态性图谱中获取特异性条带。在获得的34个多态性图谱中，仅筛选出OPF-01、P54和1253三个引物，因为它们分别对Fumigati组、A. flavus和A. niger表现出特异性条带。通过克隆和测序，从这些条带中生成SCAR标记。随后，通过检测曲霉属其他种及其他医学重要属的菌株来评估所设计标记的特异性。为评估灵敏度，使用Fumigati组、A. flavus和A. niger基因组DNA的系列稀释液（10 ng/μL–0.001 ng/μL）。最后，在来自曲霉病疑似患者的半乳甘露聚糖阳性支气管肺泡灌洗液（BAL）样本中分析SCAR-PCR检测的阳性率。

结果：引物OPF-01、P54和1253分别产生Fumigati组、A. flavus和A. niger的特异性条带。随后设计了三对引物：第一对扩增180 bp条带，对鉴定Fumigati组DNA具有组水平特异性；第二对扩增193 bp条带，可识别A. flavus；第三对在A. niger和A. luchuensis中扩增220 bp条带。这些SCAR标记被命名为AfOPF-01180、AfP54193.1和An1253220。SCAR标记的检出限为0.005 ng/μL。SCAR标记OPF-01180在BAL样本中的SCAR-PCR阳性率为19/51（37.25%）；标记AfP54193.1的SCAR-PCR阳性率为3/51（5.88%）；标记An1253220未检测到SCAR-PCR阳性。

结论：基于上述结果，所开发的SCAR标记显示出初步临床可行性，可通过AfOPF-01180标记在组水平鉴定Fumigati组DNA，并通过AfP54193.1和An1253220标记在种水平进行鉴定。然而，仍需开展前瞻性、多中心验证以评估其诊断临床应用能力。

论文解读文章

一、研究背景与立题依据

曲霉属（Aspergillus）真菌广泛分布于环境之中，目前已有453个种被确认。其中，Fumigati组（section Fumigati）的烟曲霉（A. fumigatus）、黄曲霉（A. flavus）和黑曲霉（A. niger）是人类曲霉病最重要的致病菌。随着免疫受损人群的不断增多，侵袭性曲霉病的发病率呈持续上升趋势。A. fumigatus是侵袭性感染的首要病原体，约占病例数的70%–80%，世界卫生组织已将其列为关键优先级真菌病原体；A. flavus约占感染病例的15%–20%，以产黄曲霉毒素和温暖地区分布为主要特征；A. niger引起的侵袭性感染较少，约占5%–10%，但常表现为呼吸道感染或浅表耳部感染。

临床上曲霉病的诊断主要依赖血清学生物标志物检测，如1,3-β-D-葡聚糖或半乳甘露聚糖（galactomannan），以及培养法。然而，这些技术存在非特异性或培养阳性率低等局限性。虽然基于聚合酶链反应（PCR）的新型工具已被开发用于扩增曲霉DNA，包括qPCR、多重PCR、巢式PCR、液滴数字PCR（ddPCR）和高通量测序（HTS）等技术，但这些方法均存在与患者状况相关、难以区分定植与感染、成本高昂且在发展中国家难以普及等限制。

序列特征化扩增区（Sequence Characterized Amplified Region, SCAR）分子标记是一种基于PCR的特异性分子标记，可通过随机扩增多态性DNA-PCR（RAPD-PCR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、限制性片段长度多态性（RFLP）和简单序列重复间区（ISSR）等多态性图谱开发。其中RAPD-PCR是最为高效的技术路线，因为其他标记系统成本更高、技术更复杂、执行时间更长，有时甚至需要预先具备基因组序列信息。SCAR标记在组织胞浆菌病等真菌感染的诊断中已显示出高特异性和灵敏度。目前从食品工业角度已针对曲霉属开发了SCAR标记用于鉴别产酶与非产酶菌株，但尚未有用于曲霉病诊断的SCAR标记报道。因此，本研究旨在开发并开展SCAR分子标记的初步临床评价，用于鉴定Fumigati组DNA、A. flavus和A. niger。

二、研究设计与技术方法

研究人员使用了来自墨西哥国立自治大学医学院微生物学与寄生虫学系分子真菌学实验室保藏的80株曲霉属临床和环境分离株，以及5株美国典型培养物保藏中心（ATCC）参考菌株。菌株来源涵盖墨西哥、阿根廷、法国、秘鲁和古巴等不同地理区域。

主要技术方法包括：（1）RAPD-PCR多态性图谱的获得：采用引物OPF-01、P54和1253分别获取Fumigati组、A. flavus和A. niger的特异性多态性图谱，每组实验三次重复以保证结果的重复性；（2）特异性条带的筛选、克隆与测序：从多态性图谱中选择分子量大于100 bp、在所有同种分离株中均存在且重复性好的特异性条带，经琼脂糖凝胶回收纯化后克隆至pGEM?-T Easy载体，转化至感受态大肠杆菌JM109细胞，随后进行测序；（3）SCAR标记的设计：利用Primer3程序设计特异性引物，考虑寡核苷酸长度（18–25 bp）、鸟嘌呤-胞嘧啶比值（40–60%）和退火温度（55–65 °C）等参数；（4）特异性评价：以曲霉属内不同种及其他医学重要真菌属的DNA为模板进行PCR验证；（5）灵敏度评价：采用系列稀释的基因组DNA（10 ng/μL至0.001 ng/μL）确定检出限；（6）初步临床可行性验证：使用51份来自墨西哥城INER患者库的半乳甘露聚糖阳性BAL样本进行终点PCR检测。

三、主要研究结果

（一）RAPD-PCR多态性图谱的获取

引物OPF-01产生的多态性图谱显示1000 bp、1250 bp和1500 bp的特异性条带，可用于鉴定Fumigati组；引物P54产生的多态性图谱显示350 bp、400 bp、550 bp和1300 bp的特异性条带，可用于鉴定A. flavus；引物1253产生的多态性图谱显示1000 bp、1200 bp、1300 bp和1400 bp的种特异性条带，可用于鉴定A. niger。

（二）特异性条带的克隆与序列分析

在OPF-01产生的三条组特异性条带中，仅1000 bp条带（命名为AfOPF-01(1000 bp)）成功克隆；在P54产生的四条种特异性条带中，仅400 bp条带（命名为AfP54(400 bp)）成功克隆；在1253产生的四条条带中，仅1000 bp条带（命名为An1253(1000 bp)）成功克隆。BLAST分析显示，AfOPF-01(1000 bp)仅识别Fumigati组，覆盖率和相似性均为100%；AfP54(400 bp)仅识别A. flavus，覆盖率为100%，相似性为97.94%；An1253(1000 bp)仅识别A. niger，覆盖率为100%，相似性为98.18%。开放阅读框（ORF）预测显示，Fumigati组片段含有一个102个核苷酸、编码33个氨基酸的ORF，对应RNA结合亚基复合体；A. flavus片段含有一个75个核苷酸、编码24个氨基酸的ORF，对应GRAM蛋白结构域；A. niger序列未鉴定出ORF。

（三）SCAR标记的设计与特异性、灵敏度评价

从克隆序列设计出三组SCAR引物对：AfOPF-01180扩增180 bp片段，在组水平上特异识别Fumigati组，不扩增Flavi组和Nigri组物种，也对其他医学重要真菌属无非特异性扩增；AfP54193.1扩增193 bp片段，仅识别A. flavus；An1253220扩增220 bp片段，在A. niger和A. luchuensis中均可扩增。灵敏度实验表明，三组SCAR引物的检出限一致，均为0.005 ng/μL。

（四）SCAR标记在BAL样本中的初步临床可行性

对51份半乳甘露聚糖阳性BAL样本进行SCAR-PCR检测，首选扩增未能观察到目的条带，经二次扩增（re-amplification）后：标记OPF-01180的SCAR-PCR阳性率为19/51（37.25%），可鉴定Fumigati组DNA；标记AfP54193.1的阳性率为3/51（5.88%），可识别A. flavus；标记An1253220未检测到阳性样本。

四、讨论与结论

本研究成功开发了三种SCAR分子标记，其中AfOPF-01180具有组水平特异性，仅识别Fumigati组DNA。由于同一组内被定义为姊妹种的物种无法通过形态学方法区分，如A. lentulus、A. udagawae、A. felis、A. hiratsukae和A. viridinutans，组水平分子标记的引入为曲霉病的诊断提供了优于半乳甘露聚糖检测的有效手段——后者仅在属水平上识别真菌。

值得注意的是，BAL样本中Fumigati组DNA的检出需要经过二次扩增步骤，这可能归因于样本中曲霉DNA浓度较低。虽然BAL液是诊断曲霉病最有用的生物标本，但其PCR检出率受提取方法、引物选择和方法学等因素影响。AfOPF-01180标记在BAL样本中的SCAR-PCR阳性率为37.25%，与其他曲霉属物种存在交叉反应的可能，验证其临床诊断能力尚需更大规模的研究。AfP54193.1标记在51份样本中检测到3份阳性（5.88%），虽然A. flavus是曲霉病的第二大常见病因，但针对其鉴定的诊断工具较少。An1253220标记虽可同时识别A. niger和A. luchuensis，但后者引起临床曲霉病的病例极为罕见，该标记对A. niger仍具有实用价值；其在临床样本中未检出阳性，可能与样本中真菌载量低、标本分布不均、样本质量不佳或存在PCR抑制物等因素有关。

本研究存在若干局限性：缺乏患者曲霉病分类数据；无法评估实验室结果与SCAR标记结果之间的一致性；生物样本数量和异质性有限；检出限的确定存在主观性；BAL样本的SCAR-PCR检测未设置内部扩增对照；用于特异性评价的曲霉菌株覆盖面有限。但本研究所开发的SCAR标记来源于本地的自养分离株（autochthonous isolates），考虑到曲霉属尤其是A. fumigatus的高度遗传变异性，这一特征具有重要的流行病学意义。本研究中开发的SCAR标记可在无需预先培养的情况下直接从临床样本（BAL）中扩增真菌DNA，且具有低成本、快速执行和易于解读的优势。研究结论为：AfOPF-01180标记可在组水平鉴定Fumigati组DNA；AfP54193.1是鉴定A. flavus的优良候选标记；An1253220标记对A. niger和A. luchuensis显示特异性。上述标记是快速特异性鉴定Fumigati组DNA、A. flavus、A. niger和A. luchuensis的可行候选工具，但需通过前瞻性、多中心研究进一步验证其临床诊断效能。