《Frontiers in Physiology》：High-fat diet accelerates pancreas pathology in the Cel-HYB1 mouse model
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引言： CEL基因编码胰腺消化酶羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase, CEL）。人类CEL-HYB1等位基因是CEL基因与其相邻假基因CELP的杂交变异体，在欧洲人群中与慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,
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引言： CEL基因编码胰腺消化酶羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase, CEL）。人类CEL-HYB1等位基因是CEL基因与其相邻假基因CELP的杂交变异体，在欧洲人群中与慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）风险增加五倍相关。人源化Cel-HYB1小鼠可自发发展为慢性胰腺炎，但表型相对较轻。本研究旨在进一步表征Cel-HYB1小鼠的胰腺表型。
方法： 研究人员通过两种互补策略研究Cel-HYB1动物。首先，分析了复合杂合Cel-16R/HYB1小鼠，其第二个Cel等位基因携带正常人CEL基因的16次重复（16R）可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat, VNTR）。其次，杂合和纯合Cel-HYB1动物分别喂食高脂饮食（high-fat diet, HFD）或标准饲料3个月。对所有动物进行生长、器官重量、胰腺病理和葡萄糖代谢方面的表征。
结果： 在Cel-16R/HYB1模型中，体重、胰腺重量和胰腺组织学与杂合Cel-HYB1小鼠相当。然而，在每个基因型内，雌性小鼠通常表现出比雄性更明显的胰腺组织病理学变化。雄性Cel-16R/HYB1小鼠在6月龄时脂肪沉积更大，且两性Cel-16R/HYB1动物相对于杂合Cel-HYB1小鼠均表现出略有改善的葡萄糖耐量。喂食高脂饮食时，所有小鼠组的体重均增加，无基因型依赖性差异。在此条件下，Cel-HYB1动物表现出比同窝对照更明显的胰腺组织病理学。值得注意的是，在HFD或标准饲料条件下，Cel-HYB1小鼠均未观察到一致的基因型依赖性葡萄糖耐量差异。
结论： 人源化Cel-16R等位基因未显著改变Cel-HYB1小鼠的胰腺表型，尽管Cel-16R/HYB1动物与杂合Cel-HYB1小鼠相比表现出一定程度的葡萄糖耐量改善。相比之下，高脂饮食促进了外分泌胰腺病理，支持饮食因素作为CEL-HYB1相关慢性胰腺炎疾病严重程度的潜在修饰因子。
论文解读文章
一、研究背景与目的
慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）是一种复杂的进行性胰腺破坏性疾病，环境因素和遗传变异均影响其发病风险。遗传风险因素可划分为胰蛋白酶依赖、蛋白错误折叠依赖和导管三条致病通路。其中，蛋白错误折叠依赖通路通过酶分泌受损、细胞内蛋白滞留和内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激驱动疾病发展。羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase, CEL）是由胰腺腺泡细胞分泌的消化酶，其基因CEL包含11个外显子，最后一个外显子含可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat, VNTR）区域，人类中最常见的重复数为16次。此前研究已证实，CEL的拷贝数变异体CEL-HYB1——由CEL外显子1-10与其相邻假基因CELP外显子11融合形成的杂交等位基因，仅含3个VNTR重复——在德国和法国非酒精性CP患者中频率较健康对照高五倍，并在匈牙利成人CP病例中得到重复验证，但在波兰儿童病例和三个亚洲队列中未检出，提示其为欧洲人群特异性风险因素。细胞研究已证实CEL-HYB1遵循蛋白错误折叠依赖的致病通路。两个独立研究团队已建立Cel-HYB1小鼠模型，均表现出自发性但进展缓慢的CP表型，证实了人CEL-HYB1的致病作用，并提示该模型适用于研究CP中的基因-基因和基因-环境交互作用。
基于此，本研究旨在进一步阐明CEL-HYB1易感胰腺疾病的机制，通过两种策略展开：一是构建复合杂合Cel-16R/HYB1小鼠，直接模拟人CEL-HYB1携带者的遗传组合；二是通过高脂饮食（high-fat diet, HFD）对Cel-HYB1动物施加代谢应激。
二、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术手段：通过基因打靶技术构建Cel-HYB1和Cel-16R小鼠品系（由genOway公司构建，C57BL/6N遗传背景），将小鼠Cel基因VNTR分别替换为人CEL-HYB1VNTR和正常16次重复人CELVNTR；通过纯合Cel-HYB1雄鼠与杂合Cel-16R雌鼠交配产生复合杂合Cel-16R/HYB1小鼠。动物实验经挪威动物研究管理局批准（批准号FOTS28946），饲养于挪威卑尔根大学医学院实验动物设施。采用多重PCR进行基因分型；胰腺组织经4%福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）后切片行苏木精-伊红（HE）染色，由三名研究者盲法评分炎症、脂肪替代和腺泡萎缩（0=正常，1=轻度，2=中度）；免疫组织化学检测CEL蛋白分布；随机血糖测定和腹腔内葡萄糖耐量试验（IPGTT）评估糖代谢；血清淀粉酶活性测定采用2-氯-对硝基苯基-α-D-麦芽三糖苷底物。
三、研究结果
3.1 Cel-16R/HYB1小鼠研究
3.1.1 发育与生长： 对Cel-16R/HYB1小鼠进行长达12个月的监测，与杂合Cel-HYB1同笼对照比较。Cel-16R/HYB1雄鼠体重有增高趋势而雌鼠有降低趋势，但均未达统计学显著。6月龄时Cel-16R/HYB1雄鼠附睾和皮下脂肪质量显著增加，其余器官重量无显著差异。
3.1.2 慢性胰腺炎发展： 12月龄胰腺组织学评分显示两种基因型均存在轻度组织病理改变，包括炎症、脂肪替代和腺泡萎缩。雌性小鼠普遍比雄性表现更明显的组织病理学变化。脂肪替代在雌性Cel-+/HYB1小鼠中更常见，而萎缩在雄性Cel-+/HYB1小鼠中更常见。血清淀粉酶活性无基因型间显著差异，但个别Cel-16R/HYB1小鼠在6和12月龄出现淀粉酶活性大幅升高。
3.1.3 胰腺内分泌功能： 随机血糖监测未提示糖尿病发生。IPGTT显示Cel-16R/HYB1动物总体趋势上葡萄糖耐量略优于Cel-+/HYB1，其中雄性6月龄和雌性6及12月龄的曲线下面积（AUC）差异达到统计学显著。
3.2 Cel-HYB1高脂饮食研究
3.2.1 体重和器官重量： HFD喂养的三种基因型小鼠体重均较饲料组增加，但无基因型间差异。饲料组小鼠相对胰腺重量高于HFD组，但基因型不影响胰腺重量。
3.2.2 HFD对外分泌胰腺的影响： 饲料组Cel-HYB1小鼠多数胰腺形态正常，仅两只雄性出现炎症和脂肪替代迹象。而HFD组大多数雄性和雌性Cel-HYB1小鼠表现出组织学改变，包括炎症、脂肪替代和腺泡萎缩，纯合小鼠较杂合小鼠更明显。12只HFD喂养的野生型对照中有3只出现类似改变，提示HFD单独也可诱导胰腺组织变化。Cel-HYB1 HFD组受影响小鼠比例高于对照组（15/24 vs 3/12；OR=5.0，P=0.075），但未达统计学显著。血清淀粉酶活性未因HFD或基因型显著升高。
3.2.3 胰腺CEL蛋白表达： 免疫组织化学显示，饲料组和HFD组Cel-+/+与Cel-HYB1/HYB1小鼠的CEL蛋白均以棕褐色点状分布于酶原颗粒。但HFD喂养的Cel-HYB1/HYB1小鼠在萎缩区域出现不规则且染色更强的CEL阳性结构，提示蛋白聚集。
3.2.5 内分泌功能： HFD组所有基因型小鼠IPGTT葡萄糖水平均显著高于饲料组，符合肥胖导致胰岛素抵抗的预期。值得注意的是，两种饮食条件下Cel-+/HYB1和Cel-HYB1/HYB1小鼠均倾向比野生型对照葡萄糖耐量略好，但仅少数比较达到统计学显著。
四、讨论与结论
研究人员首先探讨了正常16R VNTR的CEL蛋白是否能影响Cel-HYB1的致病性。既往细胞实验提示人CEL-HYB1的毒性作用可能被正常CEL蛋白共表达所减弱，但在杂合Cel-HYB1小鼠中，内源性小鼠Cel基因仅含3个VNTR重复。因此构建了Cel-16R/HYB1复合杂合小鼠以模拟人CEL-HYB1携带者的遗传组合。结果显示Cel-16R/HYB1与Cel-+/HYB1之间的差异未形成一致的基因型依赖性模式，16R等位基因对胰腺表型无一致的修饰效应。
HFD研究中，Cel-HYB1小鼠（15/24）较对照（3/12）出现更频繁的轻度组织病理改变，支持代谢应激和肥胖可能加重该遗传风险因素效应的观点。HFD未影响淀粉酶活性，可能反映血清淀粉酶升高仅见于急性胰腺损伤的狭窄时间窗，对慢性或轻度疾病敏感性有限。HFD导致葡萄糖耐量受损但无基因型差异，Cel-HYB1小鼠反而倾向略有改善的葡萄糖耐量，与既往遗传性CP小鼠模型中内分泌功能障碍罕见的观察一致。
关于HFD的作用机制，研究人员认为HFD并非特异性影响CEL表达，而是作为胰腺的通用代谢应激源。既往研究显示小鼠胰腺脂肪酶基因转录本在慢性HFD喂养初期升高后回落至基础水平，而CEL转录本未受显著影响。HFD在其他胰腺炎小鼠模型（如PRSS1 R122H突变小鼠）中同样加重疾病严重程度，并加速正常小鼠胰腺内脂肪积累及雨蛙素诱导的纤维化和炎症。
性别方面，HFD研究中雄性Cel-HYB1小鼠组织病理改变更频繁，而12月龄时雌性Cel-+/HYB1和Cel-16R/HYB1小鼠组织病理变化更明显；内分泌功能上雄性Cel-HYB1小鼠12月龄时葡萄糖耐量受损，而雌性则表现改善，提示性别影响表型的多个方面，方向与幅度取决于年龄、遗传背景和实验条件。
研究结论： 正常的人源化Cel-16R等位基因在基础条件下不显著改变Cel-HYB1相关的胰腺表型，而代谢应激（高脂饮食）加重外分泌胰腺表型。此外，研究还发现了潜在的性别依赖性差异。本研究进一步支持CP是多因素疾病，遗传风险因素如CEL-HYB1与环境暴露和生物学修饰因素协同作用，全面理解胰腺炎发病机制需要整合基因-基因、基因-环境交互作用及性别特异性效应的综合研究策略。
