《Frontiers in Microbiology》：Unraveling the microbiological and chemical basis of aroma differences in Great Wall cigars: insights from amplicon sequencing and volatile metabolomics
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为阐明六种长城雪茄类型间香气差异的微生物学与化学基础，研究人员将16S rRNA/ITS扩增子测序与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction coupled with
为阐明六种长城雪茄类型间香气差异的微生物学与化学基础，研究人员将16S rRNA/ITS扩增子测序与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography–mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS）相结合，以表征微生物群落组成、挥发性有机化合物（volatile organic compound, VOC）谱及潜在的微生物–VOC关联。六种雪茄类型的微生物多样性和群落组成存在差异，线性判别分析效应大小（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）鉴定出16个潜在微生物生物标志物。挥发性代谢组学分析鉴定出1620种VOCs，归属为9个化学类别。相对气味活度值（relative odor activity value, rOAV）分析与偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）的联合结果揭示17种VOCs为与六种雪茄类型间香气差异相关的关键香气化合物。值得注意的是，代表性化合物包括β-大马士酮（花香、果香、甜香）、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（烘烤香、坚果香、甜香）、δ-杜松烯（草药香、木质香）和δ-十二内酯（奶香、果香），在六种雪茄类型中表现出不同的rOAV分布模式，这可能导致这些雪茄的特征性香气特征。相关性分析进一步揭示，多个微生物属与关键香气化合物显著相关。特别是细菌属Atopostipes和真菌属Sampaiozyma与二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、β-大马士酮及其他关键香气化合物呈显著正相关。这些发现为筛选产香微生物和改善雪茄质量控制提供了有益的见解。
雪茄作为高品质烟草制品，其独特、复杂且平衡的香气特征源于采后晾制、发酵和陈化等系列工序。香气是雪茄质量的核心属性，与挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）密切相关，而微生物群落通过分泌胞外酶降解脂质、淀粉和蛋白质等大分子，释放还原糖和氨基酸等前体，再经美拉德反应、氧化降解、微生物代谢及酯化等过程转化为醇类、萜烯类、醛类、酯类和杂环化合物等香气组分。因此，解析微生物群落与VOC谱之间的关联是理解不同雪茄类型特征香气形成机制的必要前提。以往针对雪茄的研究往往将VOCs或微生物群落分开考察，缺乏对不同雪茄类型中二者关联的系统分析。尽管多组学策略已为雪茄烟叶香气形成提供见解，但跨多种雪茄类型的“微生物–VOC”整合研究仍较少。本研究选取六种长城雪茄类型，整合扩增子测序与挥发性代谢组学，系统考察其VOC谱和微生物群落组成，重点识别与香气差异相关的关键香气化合物和潜在微生物生物标志物，并探索二者关联，以期为高品质雪茄生产提供理论支持。
研究人员选取六种长城雪茄类型，包括喀麦隆国际（S1）、盛世五号（S2）、宜川老坊（S3）、奇迹132（S4）、 spectacle No.2（S5）和VegaFina Grand Corona（S6），所有雪茄由四川中烟长城雪茄厂提供，同一卷制工完成卷制，并在20°C±2°C、60%±2%相对湿度下陈化180天。每种类型随机选取6支独立生物学重复。主要技术方法包括：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）鉴定VOCs；基于16
S rRNA/ITS扩增子测序表征细菌和真菌群落；以相对气味活度值（rOAV）评估香气贡献；结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）筛选关键香气化合物；运用线性判别分析效应大小（LEfSe）鉴定潜在微生物生物标志物；通过Spearman相关分析探究微生与关键香气化合物的关联。
3.1 六种长城雪茄类型中微生物群落组成
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S rRNA/ITS扩增子测序显示，所有样本的Good's coverage均超过99.9%，测序深度充分。六种雪茄类型共享的ASV仅占细菌总ASV池的1.18%和真菌总ASV池的3.85%，而特有ASV占多数，表明微生物组成存在较大异质性。细菌群落中，Bacillota平均相对丰度最高（65.14%），其次为Actinomycetota（33.61%）；优势属为Staphylococcus（平均53.99%）和Corynebacterium（平均29.25%）。真菌群落中，Ascomycota（92.04%）和Basidiomycota（7.92%）为优势门；Aspergillus在S2–S6中占75.60%–98.29%，在S1中较低（48.07%）。S1中Stagonosporopsis和Sampaiozyma较丰富，S5中Wallemia和Xeromyces较多。
3.2 微生物群落的α多样性和β多样性
细菌α多样性指数显示，S1–S3的丰富度和多样性高于S4–S6；S3的Chao1指数最高，S2的Shannon指数最高。真菌α多样性中，S1的Chao1和Shannon指数最高，其次为S3；S6的Simpson指数最高而Shannon指数最低，提示其多样性较低且少数类群占优。基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，六种类型的细菌和真菌群落均明显分离；前两个主坐标分别解释细菌和真菌群落变异的91.43%和93.68%。置换多元方差分析（PERMANOVA）证实细菌（R2=0.976，p=0.001）和真菌（R2=0.962，p=0.001）群落组成差异显著。
3.3 基于LEfSe筛选潜在微生物生物标志物
LEfSe分析（LDA score>3.5，p<0.05）结合平均相对丰度>0.5%的筛选，最终确定16个潜在微生物生物标志物，包括9个细菌属和7个真菌属。其中，Stagonosporopsis、Sampaiozyma、Fusarium、Plectosphaerella、未分类Mycosphaerellaceae和Yaniella富集于S1；Aerococcus和Pseudomonas富集于S2；Corynebacterium、Atopostipes和未分类Bacillaceae富集于S3；Enteractinococcus富集于S4；Wallemia、Staphylococcus和Tetragenococcus富集于S5；Aspergillus富集于S6。这些属可作为区分六种雪茄类型的潜在生物标志物。
3.4 VOC谱及其组成差异
HS-SPME-GC-MS分析共鉴定出1620种VOCs，归为九类：萜烯类（349）、酯类（295）、酮类（193）、杂环化合物（163）、醇类（116）、醛类（85）、酸类（83）、酚类（81）和其他（255）。烟碱和新植二烯是最丰富的单体，二者合计占总平均相对含量的37.43%。S1在萜烯类、酯类、酮类、杂环化合物和醛类中相对含量最高，S5在醇类和酸类中最高。PCA显示同类型生物学重复紧密聚集，不同类型明显分离，且QC样本聚集良好，表明分析稳定、可重复。
3.5 基于rOAV分析的香气活性化合物鉴定
对所有具有气味阈值的VOC计算rOAV，以rOAV>1为标准，鉴定出48种香气活性化合物，包括萜烯类11种、酮类10种、酯类8种、醛类6种、醇类5种等。其中10种化合物在所有六种类型中rOAV均超过100，如二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、苯乙基异戊酸酯和β-大马士酮。
3.6 关键香气化合物筛选与香气特征分析
基于rOAV>1的化合物进行PLS-DA，模型R2Y=0.980，Q2=0.971，200次置换检验显示无过拟合。结合VIP>1、p<0.05和rOAV>1，筛选出17种关键香气化合物，含7种萜烯类、3种酮类、3种醛类、2种酯类和2种醇类。根据气味描述归类为8种香气类别：木质香、甜香、烘烤香、坚果香、果香、花香、草药香和奶香。S1和S3中苯乙基异戊酸酯、苯乙醛、异甲基-α-紫罗兰酮、β-大马士酮、2-十二酮、3-乙酰吡啶和二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮的rOAV较高，呈现更强烈的甜香、烘烤香、坚果香、果香和花香；S4和S6中黄葵内酯、δ-杜松烯和β-法尼烯的rOAV较高，木质香和草药香更突出；S2和S5则因δ-十二内酯的较高rOAV而具有更明显的奶香。
3.7 潜在微生物生物标志物与关键香气化合物的关联
Spearman相关分析显示，未分类Bacillaceae、Atopostipes、Enteractinococcus和Yaniella与3-乙酰吡啶、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮和β-大马士酮显著正相关，与δ-十二内酯显著负相关。真菌中，Stagonosporopsis、Sampaiozyma、Fusarium、未分类Mycosphaerellaceae和Plectosphaerella与3-乙酰吡啶、2-苯乙醇和苯乙基异戊酸酯显著正相关，与δ-十二内酯显著负相关。与此相反，Aspergillus与多数关键香气化合物（如3-乙酰吡啶、苯乙基异戊酸酯和2-十二酮）显著负相关。所有相关均经FDR校正。
讨论部分指出，Staphylococcus和Aspergillus分别是细菌和真菌群落的优势属，与以往雪茄研究一致。Staphylococcus可促进大分子降解，有利于香气物质富集；Aspergillus分泌淀粉酶和蛋白酶，但过度增殖可能带来霉变风险，尤其在S2、S4和S6中需加强温湿度控制。S1和S3的较高微生物多样性和更多生物标志物可能源于原料产地和加工参数的差异。关键香气化合物的rOAV分布解释了不同类型雪茄的香气差异：β-大马士酮和δ-杜松烯等以往研究亦有关键贡献，而2-苯乙醇、苯乙基异戊酸酯和δ-十二内酯则较少被报道为关键化合物。特别地，Atopostipes和Sampaiozyma与多种关键香气化合物显著正相关，提示微生物菌群的协同作用影响香气形成，但相关性不等于因果关系。未来需结合稳定同位素稀释分析（SIDA）、宏基因组学和功能验证，定量关键香气化合物并解析微生物功能基因和代谢途径。
综上所述，本研究表征了六种长城雪茄类型的微生物群落组成和VOC谱。尽管Staphylococcus和Aspergillus分别持续是优势细菌和真菌属，但六种雪茄类型的微生物组成存在差异。挥发性代谢组学分析鉴定出17种关键香气化合物，其rOAV分布的变化解释了六种雪茄类型间的香气差异。此外，Spearman相关分析显示，若干潜在微生物生物标志物——特别是Atopostipes和Sampaiozyma——与多种关键香气化合物呈显著正相关，表明它们可能对雪茄香气形成有贡献。这些发现有助于解释六种雪茄类型间的香气差异，并为筛选功能性微生物以改善雪茄质量提供了有价值的见解。
