肝细胞癌-抑郁症共病的共享免疫紊乱及氟西汀联合抗PD-1的协同免疫治疗效应

《Frontiers in Immunology》：Shared immune perturbations in hepatocellular carcinoma-depression comorbidity and synergistic immunotherapeutic effects of fluoxetine combined with anti-PD-1

　　

背景： 肝细胞癌（HCC）常与抑郁症共存，使患者死亡率升高39%。色氨酸代谢轴桥接了肿瘤与神经精神免疫功能障碍，然而HCC-抑郁症共病背后的免疫代谢交互作用仍不明确，且缺乏可靠的联合免疫疗法。 方法： 研究人员整合了包括TCGA、GEO、eQTLGen和FinnGen在内的公共多组学数据集，进行了两样本孟德尔随机化（MR）及遗传共定位分析，以筛选与HCC-抑郁症共病相关的枢纽基因。采用GSEA/GSVA、单细胞和空间转录组学来解析基因表达及受扰动的色氨酸免疫通路。计算机模拟对接预测了氟西汀与BTN3A3、GLCE和RBCK1的结合。利用Hepa1-6/CUMS共病小鼠模型，结合靶向色氨酸液相色谱-串联质谱（LC-MS）代谢组学、流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA），验证了联合治疗效果及组织分子改变。 结果： 鉴定出7个HCC与抑郁症共有的风险基因。其中BTN3A3、GLCE和RBCK1达到了严格的共定位阈值（SNP.PP.H4 > 0.90），并且主要在T细胞和与色氨酸代谢相关的M2巨噬细胞中表达。通过分子模拟，氟西汀显示出与所有三种枢纽蛋白的稳定结合亲和力。体内实验证明，氟西汀联合抗PD-1可抑制共病小鼠的肿瘤进展，缓解抑郁样表型，使组织GLCE/RBCK1水平正常化，并恢复紊乱的色氨酸代谢和免疫抑制微环境。 结论： 本研究阐明了HCC-抑郁症共病中色氨酸介导的免疫紊乱特征。GLCE和RBCK1与共病免疫代谢紊乱相关。氟西汀联合抗PD-1通过重塑色氨酸相关的免疫稳态发挥协同免疫调节作用，为同时患有HCC和抑郁症的患者提供了一种临床前的代谢免疫治疗策略。

肝细胞癌-抑郁症共病的共享免疫紊乱与氟西汀联合抗PD-1的协同免疫治疗效应：一项多组学整合与体内验证研究

1. 研究背景与科学问题

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球高发的恶性肿瘤，而抑郁症是其最常见的精神共病之一，约20.7%的肝癌患者伴有抑郁症状，且共病状态使患者死亡率增加39%。尽管免疫检查点抑制剂如PD-1单克隆抗体在多种恶性肿瘤中取得突破性疗效，但其可能诱发中枢神经系统等器官的免疫相关不良事件。另一方面，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI）氟西汀（fluoxetine, FXT）作为经典抗抑郁药，已有报道显示其与降低癌症发病率和死亡率相关。然而，这两种药物在HCC-抑郁症共病中是否存在协同效应，以及其潜在调控基因和网络机制尚不清楚。既往研究证实，色氨酸（tryptophan, Trp）代谢异常及其导致的免疫失调是驱动HCC与抑郁症共病的核心病理交叉环节，但关键的免疫代谢交互作用仍未被充分解析，也缺乏可靠的联合免疫治疗方案。因此，本研究旨在从多组学层面系统解析HCC-抑郁症共病的分子机制，识别与色氨酸驱动的免疫代谢相关的潜在治疗靶点，并评估氟西汀联合抗PD-1的协同治疗潜力。

2. 研究方法概述

研究人员首先整合了来自TCGA、GEO、eQTLGen和FinnGen（欧洲裔人群，肝癌病例947例对照378,749例，抑郁症病例59,333例对照434,831例）的公共多组学数据，通过两样本孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）和遗传共定位分析筛选HCC-抑郁症共病的共享枢纽基因。随后利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）、基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）、单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）和空间转录组学技术，解析基因表达模式及受扰动的色氨酸免疫通路。通过计算机分子对接预测氟西汀与候选蛋白的结合能力。最后，建立皮下Hepa1-6肝癌移植瘤联合慢性不可预测温和应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）的C57BL/6小鼠共病模型（每组8只用于表型测量，3只用于分子检测），结合靶向色氨酸超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS）代谢组学、流式细胞术和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），验证联合治疗效果及组织分子变化。

3. 主要研究结果

3.1 氟西汀联合抗PD-1对HCC-CUMS共病小鼠的干预效果

在Hepa1-6/CUMS共病模型中，氟西汀单药或抗PD-1单药均能中度抑制肿瘤进展，而联合用药组对肿瘤体积和重量的抑制作用最强。苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色显示联合治疗减轻了肿瘤病灶内的炎症浸润，Ki-67免疫组化表明肿瘤细胞增殖受到抑制。行为学测试中，共病模型表现出明显的抑郁样行为，包括糖水偏好下降和强迫游泳实验中不动时间延长；氟西汀单药显著改善抑郁行为，而抗PD-1单药几乎无抗抑郁效果，联合用药则显著逆转了抑郁样症状和三箱社交互动中的社交回避行为。

3.2 MR和共定位分析鉴定HCC与抑郁症的7个共享基因

通过两样本eQTL-MR分析，初步筛选出HCC和抑郁症的正向因果信号，韦恩图确定了7个重叠的共享因果基因，包括2个保护性基因（VPS33B、GLCE）和5个风险基因（RBCK1、RAC1、FPGT、DRD4、BTN3A3）。敏感性分析和异质性检验排除了显著的异质性和水平多效性，巩固了因果关联的稳健性。

3.3 枢纽基因GLCE、RBCK1和BTN3A3的遗传共定位特征**

整合GWAS和eQTL数据进行遗传共定位分析，发现GLCE、RBCK1和BTN3A3在HCC和抑郁症中均达到显著共定位信号（SNP.PP.H4 > 0.90）。区域共定位图显示，RBCK1呈现最尖锐的共定位峰，GLCE在两个表型中均有稳健的重叠峰，BTN3A3虽LD范围较宽但仍覆盖两种疾病的共享风险位点。转录因子富集分析发现E2F4（基序cisbp_M2272）是三个枢纽基因的共同上游调控因子，标准化富集分数最高。

3.4 GSVA和GSEA揭示与色氨酸代谢紊乱相关的共享炎症通路

在HCC数据集中，GLCE富集于促炎和肿瘤增殖通路，RBCK1参与免疫调节和色氨酸代谢过程，BTN3A3与促进肿瘤进展的免疫激活信号相关。在抑郁症数据集中，GLCE通过炎症代谢信号扰乱神经免疫稳态，RBCK1调节系统性免疫炎症平衡，BTN3A3调控突触功能和免疫通路诱导异常神经元活动。群体水平的GSEA进一步证实，HCC和抑郁症中均显著富集了肿瘤坏死因子α/核因子κB（TNFA/NF-κB）信号、炎症反应、白细胞介素6-酪氨酸激酶-信号转导及转录激活因子3（IL6-JAK-STAT3）轴和干扰素γ应答等关键炎症级联通路。

3.5 免疫浸润景观及枢纽基因与M2巨噬细胞介导的免疫抑制的相关性

免疫细胞浸润分析显示，HCC和抑郁症样本中M2型巨噬细胞比例均显著升高。流式细胞术证实，与共病模型组相比，氟西汀联合抗PD-1组外周血中CD206⁺M2巨噬细胞比例显著降低。相关性热图表明三个枢纽基因的表达水平与M2巨噬细胞丰度及多个免疫抑制性免疫亚群呈正相关。ELISA定量结果显示，共病小鼠血清中免疫抑制性细胞因子白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）和转化生长因子-β（transforming growth factor-beta, TGF-β）浓度显著升高，联合干预对其分泌的抑制作用最为明显。

3.6 人HCC组织中单细胞转录组图谱揭示枢纽基因分布及犬尿氨酸通路富集

对人HCC组织的scRNA-seq数据分析后，注释出9种细胞亚群。特征图和提琴图显示BTN3A3主要在T细胞中富集，GLCE在肝细胞中高表达，RBCK1在内皮细胞中高表达。通路活性热图表明犬尿氨酸代谢通路显著富集，伴随其限速酶基因表达升高。

3.7 抑郁脑组织中单细胞转录组图谱揭示枢纽基因表达模式和犬尿氨酸通路富集

在抑郁脑组织的scRNA-seq中，兴奋性神经元、抑制性神经元和星形胶质细胞构成主要细胞群。GLCE在星形胶质细胞簇中表达较高，BTN3A3在小胶质细胞簇中信号最强，RBCK1在兴奋性神经元中表达突出。与HCC单细胞结果一致，犬尿氨酸代谢通路同样显著富集。

3.8 HCC-CUMS小鼠脑和血清的整合转录组与靶向色氨酸LC-MS/MS代谢组学分析

主成分分析（principal component analysis, PCA）显示各组间脑和血清标本存在清晰的代谢分离。靶向定量检测表明，共病模型组L-色氨酸（L-Trp）显著降低而L-犬尿氨酸（L-Kyn）升高，联合治疗在很大程度上恢复了这两个核心代谢物的异常水平。火山图鉴定了大量差异代谢物，双向层次聚类热图展示了吲哚系列差异代谢物在各组间的不同聚类模式。联合京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析一致指出色氨酸代谢（mmu00380）是最显著受扰动的通路。

3.9 人HCC组织的空间转录组多组学分析

通过RCTD细胞类型解卷积，在HCC组织切片中解析了细胞空间定位，肝细胞占主导地位。空间特征图可视化显示了三个枢纽基因的区域性表达，RBCK1在其中一个样本中表现出更广泛和更强的表达信号。细胞-细胞通讯网络和相互作用强度热图揭示了肝细胞与成纤维细胞、内皮细胞等基质群体之间存在广泛的配体-受体交互。PROGENy通路活性评分揭示了细胞类型特异性的信号特征。

3.10 氟西汀与枢纽蛋白的结合预测及组织表达验证

分子对接预测氟西汀与BTN3A3、GLCE和RBCK1均具有稳定的结合亲和力，其中与BTN3A3的对接分数最优。蛋白质印迹法（Western blot）检测显示，与共病模型组相比，模型组脑、肝和肿瘤组织中RBCK1蛋白表达升高而GLCE表达降低；氟西汀单药、抗PD-1单药及联合用药均可部分或完全逆转这些异常蛋白变化。前额叶皮质免疫组化染色进一步证实共病小鼠中GLCE阳性信号减弱，而联合治疗恢复了GLCE蛋白丰度。

4. 讨论与结论

讨论总结： 本研究系统描绘了以色氨酸-犬尿氨酸信号紊乱为核心的HCC-抑郁症共病共享免疫代谢轴。不同于以往仅依赖转录富集推断的研究，本研究结合转录-代谢物数据集提供了绝对定量的代谢证据，验证了脑和外周循环中受扰动的色氨酸-犬尿氨酸通量。通过严格的共定位阈值筛选出三个枢纽基因，单细胞和空间转录组学进一步绘制了其细胞类型特异性定位。三个基因均满足相同的遗传共定位标准，但其转化前景需差异化解读：BTN3A3为灵长类特有基因，无法在常规啮齿动物模型中进行体内功能验证；而GLCE和RBCK1在小鼠中存在同源物，并在免疫代谢调控中发挥更广泛的调节作用。动物数据阐明了氟西汀联合抗PD-1的协同免疫代谢机制：联合方案抑制了肿瘤增殖，缓解了抑郁样表型，减少了外周M2巨噬细胞比例并降低了血清IL-10/TGF-β浓度，同时使脑和血清中紊乱的L-色氨酸和L-犬尿氨酸池恢复正常。研究也指出多项局限性，包括所有MR数据均来源于欧洲人群而未在东亚乙型肝炎病毒相关HCC人群中验证、缺乏枢纽基因的细胞功能获得/缺失模型及体内基因拯救实验、未设置吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）抑制剂阳性对照组、未收集临床共病患者匹配标本等，后续工作将补充相应证据。

研究结论： 这项多层次临床前研究整合了生物信息学多组学分析和小鼠体内实验，确定GLCE、RBCK1和BTN3A3是通过失调的色氨酸-犬尿氨酸免疫代谢信号连接肝细胞癌和抑郁症的共享枢纽基因。机制性动物数据进一步证明，氟西汀联合抗PD-1治疗产生协同的抗肿瘤和抗抑郁功效。该联合方案重塑了以M2巨噬细胞富集为特征的免疫抑制微环境，并恢复了紊乱的系统性色氨酸代谢平衡，为HCC-抑郁症共病提供了一种有前景的临床前干预策略。