《Frontiers in Microbiology》：Tight junction suppression by candidalysin promotes gut-to-blood dissemination of Candida albicans
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**摘要专业翻译：**
**背景：** 共生真菌白色念珠菌（*Candida albicans*）作为人类肠道的天然栖息菌，可向致病状态转变并播散入血。肠黏膜屏障的破坏，尤其是通过损伤上皮细胞完整性和细胞间连接，是该播散过程中的关键步骤。尽管Candidal
**摘要专业翻译：**
**背景：** 共生真菌白色念珠菌（*Candida albicans*）作为人类肠道的天然栖息菌，可向致病状态转变并播散入血。肠黏膜屏障的破坏，尤其是通过损伤上皮细胞完整性和细胞间连接，是该播散过程中的关键步骤。尽管Candidalysin是由*ECE1*（细胞伸长程度1基因，*extent of cell elongation 1 gene*）编码的成孔溶细胞肽，但其与播散过程中特异性肠道紧密连接蛋白（tight junction, TJ）丰度和组织化之间的关系仍未完全阐明。
**方法/主要发现：** 本研究采用小鼠模型和人结肠上皮细胞（NCM-460）来研究Candidalysin对真菌播散的影响及其与紧密连接蛋白丰度和分布变化的关联。在体内实验中，感染Candidalysin缺陷型白色念珠菌突变株的小鼠保留了紧密连接结构，显著减轻了促炎细胞因子反应，并显著降低了血液中可检测到的真菌DNA的频率和数量。与此相反，野生型（WT）和*ECE1*回复株感染的小鼠血清中促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平升高，同时伴随紧密连接蛋白组分（ZO-1、Occludin和Claudin-1）表达下降。在体外实验中，使用纯化的Candidalysin证明了其对紧密连接蛋白具有双相、剂量依赖性效应。在3.125 μg/mL时，紧密连接相关信号得到保留，选定的蛋白质测量值适度升高，而转录水平显示轻度下降。在较高浓度下（≥12.5 μg/mL，最高至50 μg/mL），较高的Candidalysin浓度与紧密连接相关信号的显著丧失和不连续性以及所选紧密连接蛋白丰度的降低相关。
**结论/意义：** Candidalysin对上皮连接相关蛋白的剂量依赖性效应支持其在肠道发病机制中的情境依赖性贡献。这些发现将Candidalysin与本模型中的上皮损伤和播散相关联，但并未确立二元分子开关或Candidalysin专有机制。阐明Candidalysin如何协调上皮和免疫通路，为维持肠道-真菌共生的机制提供了新见解，并可能揭示保留黏膜完整性和预防系统性念珠菌病的治疗靶点。
**论文主体内容解读文章：**
**一、研究背景与科学问题**
侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis, IC）是由白色念珠菌（*Candida albicans*）引起的严重真菌感染，是医院获得性真菌血流感染的主要原因之一，具有高发病率、高死亡率及显著的治疗挑战。作为人类肠道的共生居民，白色念珠菌在感染过程中可从良性酵母形态转变为侵袭性菌丝形态，这一转变连同其他真菌毒力因子及与宿主防御的复杂相互作用，共同决定疾病进展和严重程度。在此背景下，Candidalysin这一由*ECE1*基因编码的菌丝相关肽毒素，被认为是黏膜损伤的关键决定因素。该毒素为31个氨基酸组成的α-螺旋肽，优先在菌丝生长期间产生，通过在宿主膜内聚合形成孔道，导致膜破裂、钙内流和宿主细胞裂解。除直接细胞毒性外，Candidalysin还激活上皮信号通路并诱发强效炎症反应，包括细胞因子释放和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成。
尽管Candidalysin依赖性上皮损伤和肠道转位已被证实，但特定肠道紧密连接蛋白组分在体内的贡献和调控及其与播散和残余疾病严重程度的关系仍未完全明确。特别是Candidalysin是否通过靶向ZO-1、Occludin或Claudin-1来破坏肠道屏障——无论是通过改变其表达还是亚细胞定位——仍是一个关键的知识缺口。上皮紧密连接（ETJ）在维持肠道屏障完整性和调节营养吸收的选择性通透性方面发挥关键作用，其中ZO-1作为细胞质衔接蛋白，将Occludin和Claudin-1等跨膜蛋白锚定至肌动蛋白细胞骨架，确保紧密连接的结构稳定性。屏障损伤通常以这些关键蛋白的分布改变和表达降低为特征。因此，阐明Candidalysin对肠道紧密连接蛋白的调控机制及其在肠道-血液播散中的作用，对于理解白色念珠菌侵袭过程至关重要。
**二、研究目的与核心发现**
研究人员旨在通过体内基因匹配菌株的等基因比较和体外人体结肠上皮细胞模型，系统考察Candidalysin对肠道紧密连接蛋白丰度与分布、真菌播散及全身炎症的影响。研究采用受控的鼠肠腔内感染模型，将野生型[WT (1477)]、*ECE1*基因敲除株[ece1Δ/Δ (2057)]和*ECE1*回复株[ECE1-reconstituted (2059)]注入回肠末端，并通过组织病理学、PAS染色、ddPCR定量、细胞因子检测、Western blot、免疫组织化学等多种手段评估致病结局。体外实验则使用NCM-460人结肠上皮细胞系，考察纯化Candidalysin在不同浓度下（3.125、12.5和50 μg/mL）对紧密连接蛋白表达、定位、转录水平以及上皮屏障通透性的影响。
**（一）ECE1基因缺失减轻小鼠肠道组织病理**
在感染后48小时，组织病理学分析显示肠道炎症强烈依赖于ECE1表达。WT和ECE1回复株感染的小鼠出现严重的肠道炎症，黏膜结构完全丧失，病理损伤评分显著高于阴性对照；而ece1Δ/Δ感染的小鼠肠道炎症明显减轻，黏膜结构保留，损伤评分显著低于WT和ECE1回复株感染组。PAS染色和粪便真菌负荷定量结果与之一致：WT和ECE1回复株感染组小鼠肠道黏膜可见大量真菌细胞，粪便真菌菌落形成单位（CFU）数在48小时即显著升高；相反，ece1Δ/Δ感染小鼠组织中真菌明显减少，粪便CFU也显著低于WT和ECE1回复株感染组。这表明ECE1/Candidalysin在该受控感染模型中促进肠道真菌持续/恢复、黏膜损伤和炎症。
**（二）Candidalysin缺陷减轻肠道感染后全身器官损伤和死亡率**
ECE1缺失在减少局部肠道病变方面显著，也显著减轻全身疾病程度。组织病理学分析显示，WT和ECE1回复株感染的小鼠出现严重侵袭性念珠菌病的特征性器官损伤，包括心脏的肌炎伴单核细胞浸润和局灶性坏死、肝脏的多灶性炎症病变伴肝细胞变性和微脓肿形成、脾脏的淋巴耗竭和髓外造血、肾脏的肾小管间质性肾炎伴上皮损伤，以及肺部的弥漫性间质性肺炎伴肺泡水肿和出血。相比之下，ece1Δ/Δ感染的小鼠仅见轻微的炎症浸润或局灶损伤，器官整体结构基本保留。这些病理差异直接转化为存活差异：感染后第3天，未感染对照组无死亡率，而所有WT感染小鼠均已死亡，ECE1回复株感染组的死亡率也达到100%。值得注意的是，尽管ece1Δ/Δ感染组死亡率较产Candidalysin菌株显著改善，但仍有75%的小鼠未存活至终点，表明白色念珠菌感染导致的疾病严重程度之间存在多种机制共同参与。
**（三）Candidalysin促进肠源性念珠菌血症**
研究人员采用微滴数字PCR（ddPCR）定量外周血中白色念珠菌基因组DNA来评估血行播散。结果显示，Candidalysin产生株[WT和ECE1回复株]感染的小鼠中，57%（4/7）检测到阳性念珠菌基因组DNA信号，平均阳性微滴振幅分别为3,236和2,100；相比之下，突变株感染的小鼠中仅有14%（1/7）检测到阈值以上的阳性信号，且该阳性滴度振幅（810）显著低于WT和ECE1回复株感染组。这一结果支持ECE1介导的黏膜损伤促进或便于血行入侵，但ece1Δ/Δ感染小鼠中存在的低水平阳性信号提示在没有ECE1的情况下播散仍可发生。
**（四）肠道源性念珠菌病促进全身炎症反应**
小鼠的WT感染组血清TNF-α（987.7 ± 328.2 pg/mL）、IL-1β（125.4 ± 3.0 pg/mL）和IL-6（76.8 ± 32.6 pg/mL）水平显著升高；ECE1回复株感染组产生了类似升高的细胞因子。相比之下，ece1Δ/Δ感染组IL-6水平与回复株相当（56.7 ± 18.1 pg/mL），IL-1β水平略有下降（113.0 ± 13.7 pg/mL；p < 0.05），而TNF-α近乎减半（522.7 ± 189.0 pg/mL；p < 0.01）。结肠穿孔对照实验显示，机械性损伤显著增加了IL-6和TNF-α，而IL-1β保持不变，表明IL-1β是念珠菌特异性反应，而IL-6和TNF-α可由机械损伤和感染共同驱动。值得注意的是，即使Candida-deficient感染组真菌负担和病理减少，但IL-1β的持续升高和IL-6的维持可能与持续死亡率相关。
**（五）Candidalysin破坏肠道紧密连接蛋白**
通过Western blot和免疫组织化学检测肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1。感染后48小时，WT和ECE1回复株感染的小鼠肠道组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白水平相比未感染对照显著降低；而ece1Δ/Δ感染的小鼠则显示出轻微降低，表达基本保留。IHC结果与之一致：在WT和ECE1回复株感染小鼠的肠道黏膜中，ZO-1、Occludin和Claudin-1染色信号显著丢失，染色强度减弱，黏膜结构破坏；而ece1Δ/Δ感染小鼠的连续且均匀分布以及蛋白质染色，特别是ZO-1和Occludin的保留，与未感染对照相当。
**（六）Candidalysin浓度的剂量依赖性TJ相关信号调控**
免疫荧光显微镜显示Candidalysin对TJ蛋白具有双相效应（biphasic response，即低剂量和高剂量下产生方向相反或不同性质的生物学反应的现象）。在3.125 μg/mL的低浓度下，TJ连续性和荧光信号处得以保留，Occludin和Claudin-1的荧光强度相比未刺激对照有轻度且一致性的增强。而在≥12.5 μg/mL的中等浓度下，三种TJ蛋白均出现显著的胞质错位和信号大量丢失，紧密连接结构的显著破坏。在50 μg/mL的高浓度下，观察到紧密连接的近乎完全溶解，其中Occludin和Claudin-1受影响最为严重。Western blot结果进一步揭示了剂量依赖的蛋白变化差异：ZO-1在3.125 μg/mL时显著升高并在50 μg/mL时明显降低；Claudin-1在50 μg/mL时显著降低，3.125 μg/mL时略有下降；Occludin在两个浓度下基本不变。此外，在20 μg/mL Candidalysin暴露下发生了明显的结构崩塌和细胞轮廓紊乱，与之不同的是Dsg2作为桥粒蛋白在Candidalysin刺激和未刺激条件下保持稳定。
**（七）高浓度Candidalysin增加上皮通透性**
FITC-dextran水平定量通透性测定显示，与对照的0通量处理单层相比，3.125 μg/mL Candidalysin暴露未增加FITC-dextran流量（为对照的 0.92倍，p = 0.584），表明此浓度下不增加屏障通透性。相反，12.5和50 μg/mL Candidalysin暴露使FITC-dextran通量分别增至对照的2.14倍（p < 0.0001）和4.00倍（p < 0.0001），为高浓度条件下上皮屏障功能受损提供了功能性证据。
**（八）Candidalysin抑制紧密连接基因的转录**
qPCR分析显示，在50 μg/mL高浓度Candidalysin暴露下，ZO-1、Occludin和Claudin-1的转录水平均显著下调（p < 0.01）；在3.125 μg/mL时，三个基因的转录水平也有轻度下调（p < 0.05）。这种转录抑制与蛋白水平的变化相一致，表明Candidalysin可能通过共同调控基因转录和蛋白质代谢影响紧密连接完整性，进一步加剧屏障损伤。
**三、总结与讨论**
本研究结果强调Candidalysin主要通过破坏上皮屏障功能促进肠道-血液播散，但并非侵袭性疾病的唯一驱动因素。即使ECE1缺失导致显著减少的转位相关信号、组织损伤和相对保留的紧密连接，但75%的ece1Δ/Δ感染小鼠仍出现致命结局，这提示存在Candidalysin非依赖性的真菌和宿主机制贡献。残余疾病可能反映手术相关的黏膜损伤、白细胞介素等宿主反应及Candidalysin非依赖转位。
值得注意的是，此研究存在若干局限性。首先，手术肠腔内接种模型提供了同步的真菌挑战，但难以反映自然条件下肠道菌群失调-黏膜定植-进行性侵袭的连续过程。其次，尚未确定驱动Candidalysin相关TJ改变的信号通路。TCJ蛋白表达和连接组织的改变可能被影响蛋白周转和转变以及上皮损伤等机制混淆，TCJ信号的减少不应被解释为直接蛋白降解证据。此外，低浓度的混合蛋白转录反应不支持屏障强化的结论，而高浓度条件下观察到转录和蛋白信号的改变及其与通透性增加的关联，是Candidalysin显著促进上皮屏障损伤的有力证据。Candidalysin排斥宿主屏障机制可能与EGFR、MAPK/ERK及NF-κB相关通路有关，但直接参与还有待研究。
本研究的一般性结论支持，紧密连接蛋白代表了Candidalysin作用提供可机源性节点的概念。中和Candidalysin或保护上皮屏障可能是预防高危宿主肠道来源真菌播散并改善全身念珠菌病预后的有效策略。未来研究需进一步揭示Candidalysin上下游信号通路、评估上皮细胞存活与屏障功能恢复，并采用更接近自然生理条件的胃肠道定植模型，以功能性地界定Candidalysin与其他真菌毒力因子及宿主应答的相互作用，为临床转化提供更充分的实验基础。
