《Frontiers in Immunology》：A palmitoylation-associated three-gene signature predicts prognosis, immune features, and drug sensitivity in gastric cancer: functional validation of CTHRC1
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背景： 胃癌（Gastric cancer, GC）是一种异质性恶性肿瘤，需要改进的分子工具用于预后分层。蛋白质棕榈酰化（palmitoylation）调控膜定位与信号转导，但棕榈酰化相关基因（palmitoylation-related genes, PRG
背景： 胃癌（Gastric cancer, GC）是一种异质性恶性肿瘤，需要改进的分子工具用于预后分层。蛋白质棕榈酰化（palmitoylation）调控膜定位与信号转导，但棕榈酰化相关基因（palmitoylation-related genes, PRGs）在胃癌中的临床意义仍不明确。
方法： 研究人员整合了基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和GeneCards数据以鉴定PRGs。采用差异表达分析、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和三种机器学习算法筛选关键基因。在TCGA-STAD、平台特异性GEO队列及包含80对组织的机构队列中评估了诊断和预后性能。分析了免疫浸润、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、免疫治疗相关指标及基于GDSC的药物敏感性。进一步利用临床标本、细胞实验和异种移植瘤对CTHRC1进行了验证。
结果： 研究鉴定出13个差异表达的PRGs，并筛选出SERPINE1、CTHRC1和EGR1。整合诊断模型在TCGA-STAD中AUC为0.935，在GSE54129中为1.000，在GSE118916中为0.916。三基因评分在TCGA-STAD总队列、训练队列和测试队列以及GSE84437、GSE236522和机构队列中均能对总生存期进行分层，并在多变量分析中保持独立预后价值。高风险肿瘤表现出间质和免疫评分升高、免疫细胞组成改变、检查点表达升高和TIDE评分升高。单细胞分析显示SERPINE1和CTHRC1主要定位于成纤维细胞相关区室。CTHRC1敲低可降低胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和异种移植瘤生长，同时增加凋亡。
结论： SERPINE1/CTHRC1/EGR1特征在胃癌中提供预后及免疫-间质信息，实验支持CTHRC1的促肿瘤作用。该研究定义了一个棕榈酰化相关的转录框架，但未建立棕榈酰化依赖性机制。
论文解读
一、研究背景与科学问题
胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，在东亚地区疾病负担尤为沉重。尽管内镜检测、外科技术、围手术期化疗、靶向治疗和免疫检查点阻断均取得进展，但晚期或复发患者的预后仍然不佳。当前治疗决策主要依赖解剖学分期和组织病理学评估，然而相同TNM分期的患者可能表现出截然不同的临床病程和治疗反应，因此亟需额外的分子和微环境生物标志物以完善预后评估和治疗研究。
TCGA将胃腺癌分为EB病毒阳性、微卫星不稳定、基因组稳定和染色体不稳定四种分子亚型，亚洲癌症研究组也基于表达谱建立了具有不同复发模式和生存结局的分子分型体系。这些框架表明胃癌并非单一疾病实体，而是由肿瘤内在改变和微环境状态共同塑造的异质性肿瘤群。然而，分子分型尚未完全解决对简单、可重复且能与生物学机制关联的预后工具的需求。
蛋白质棕榈酰化（又称S-酰化）是一种可逆的翻译后脂质修饰，脂肪酸链共价连接至半胱氨酸残基，调控蛋白质运输、膜结合、亚细胞定位和信号转导，进而影响受体信号、细胞黏附与迁移。癌症相关研究表明棕榈酰化失调可调节致癌信号、转移行为和肿瘤-免疫相互作用。然而，现有胃癌生物标志物研究多聚焦于常规致癌通路或免疫检查点，PRGs与预后、免疫-间质重塑、单细胞定位及功能验证之间的关系仍缺乏系统定义。此外，基于GDSC的药物敏感性分析可提供将分子特征与细胞系药物反应模式关联的框架，为个体化治疗选择提供线索。因此，本研究旨在整合公共组学数据、临床样本和实验验证，建立可信的PRG相关生物标志物框架。
二、主要关键技术方法
研究人员整合了GEO（GSE54129、GSE118916、GSE84437、GSE236522）、TCGA-STAD和GeneCards数据库数据，通过limma差异表达分析、WGCNA和三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、随机森林）筛选关键基因，构建了包含SERPINE1、CTHRC1和EGR1的逻辑回归诊断模型及Cox比例风险预后评分模型。免疫浸润分析采用ESTIMATE、CIBERSORT、xCell、quanTIseq、TIMER和EPIC等多种算法，单细胞分析基于TISCH资源中的STAD_GSE167297数据，药物敏感性分析基于GDSC资源，药物-基因相互作用检索自DGIdb数据库。临床验证使用了安徽医科大学第四附属医院伦理委员会批准的80对胃癌及癌旁组织队列，以及含36例免疫治疗记录的机构队列。
三、研究结果
3.1 差异表达与功能富集分析。 在合并校正后的GSE54129和GSE118916数据中，差异表达基因富集于白细胞迁移、粒细胞趋化、细胞外基质组织等生物学过程，KEGG分析显示细胞骨架调控、PI3K-Akt信号、黏着斑、ECM-受体相互作用、TNF信号、NF-κB信号、IL-17信号和趋化因子信号等通路富集，提示胃癌与正常组织的转录差异与基质重塑和免疫细胞转运密切相关。
3.2 关键PRG相关基因的鉴定与诊断评估。 WGCNA蓝色模块与肿瘤表型显著正相关，与差异表达基因和GeneCards来源的3307个PRGs取交集获得13个DEPRGs。三种机器学习算法的交集确定了SERPINE1、CTHRC1和EGR1三个共享生物标志物。整合诊断模型在TCGA-STAD中AUC为0.935，在GSE54129中为1.000，在GSE118916中为0.916，表现出跨数据集一致的诊断判别能力。
3.3 三个关键基因的突变负荷及免疫微环境特征。 TCGA-STAD中三个模型基因的体细胞改变不常见，17例肿瘤含有至少一个改变。改变组总生存期和无病生存期较未改变组差。高风险组TMB较高，高TMB与较差生存相关，联合TMB-风险分层可区分四组不同生存结局的患者。
3.4 PRG相关风险模型的构建、验证及独立预后价值。 多变量Cox模型生成风险评分=0.1785×SERPINE1+0.0706×CTHRC1+0.0098×EGR1。353例TCGA-STAD患者按中位数分为高低风险组，Kaplan-Meier分析显示高风险组在总队列、训练队列和测试队列中总生存期均显著较差。GSE84437中高风险组HR=1.65，GSE236522中HR=5.48。多变量分析中年龄、M分期和风险评分独立关联生存。风险评分OS判别AUC为0.750，优于各临床病理变量，时间依赖性AUC从1年0.602升至5年0.750。整合年龄、M分期和风险组的列线图可估计1、3、5年OS。
3.5 风险评分与免疫及间质重塑的关联。 CIBERSORT显示高风险组记忆B细胞、静息CD4记忆T细胞、活化NK细胞和嗜酸性粒细胞比例较低，而静息NK细胞、M2巨噬细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞比例较高。ESTIMATE分析显示高风险组StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore均显著升高，风险评分与StromalScore相关性最强（R=0.545），提示细胞外基质和成纤维细胞相关生物学是特征的主要组成部分。
3.6 核心PRGs的单细胞定位。 单细胞分析显示SERPINE1和CTHRC1表达主要集中于成纤维细胞相关间质区室，EGR1分布更广泛。模型基因与CAF标志物（PDGFRA、PDGFRB、FAP、COL1A1）及TAM标志物（CD163、MRC1、MSR1、IL10、TGFB1）呈正相关，表明体组织表达部分反映成纤维细胞丰度或活化状态。
3.7 探索性免疫治疗相关分析。 高风险组多种检查点基因表达升高，但TIDE预测的应答者比例较低（22.15% vs 49.15%），TIDE评分较高，提示免疫浸润但功能失调或排斥的微环境状态。机构胃癌免疫治疗队列中，非应答者三个基因表达和综合风险评分均较高，风险评分预测应答AUC为0.869。
3.8 GDSC药物敏感性分析。 高风险细胞系对5-氟尿嘧啶和曲美替尼敏感性较低，对顺铂、奥沙利铂、多西他赛和吉西他滨敏感性较高，表明三基因状态与胃癌细胞系药物基因组变异相关。
3.9 三基因特征的临床验证。 80对配对组织qRT-PCR显示SERPINE1、CTHRC1和EGR1 mRNA在肿瘤中均显著高表达。临床风险评分将患者分为高低风险组，高风险组OS显著较差（HR=4.15），时间依赖性AUC在1年、3年和5年分别为0.797、0.762和0.849。CTHRC1表现出最清晰的肿瘤相关蛋白染色模式。
3.10 CTHRC1敲低抑制体外恶性表型。 三种胃癌细胞系中三个基因表达均高于正常胃上皮细胞。CTHRC1敲低显著降低CCK-8增殖、EdU阳性细胞比例、克隆形成、伤口愈合迁移率和Transwell迁移/侵袭能力。
3.11 CTHRC1敲低抑制异种移植瘤生长并增加凋亡。 裸鼠皮下异种移植模型中，CTHRC1敲低组肿瘤体积和重量显著降低，TUNEL阳性细胞增加，Bax和cleaved caspase-3表达升高，Bcl-2表达降低，表明CTHRC1在体内支持抗凋亡表型。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，该研究的主要优势在于整合公共发现数据集、内外部队列预后评估、80对机构组织队列、单细胞定位以及CTHRC1的体内外功能验证。风险评分一致地识别出生存较差的患者，高风险组最显著的生物学特征是间质丰富、免疫重塑的微环境。然而，该研究未证明评分是整体棕榈酰化水平的直接度量，也未证明观察到的CTHRC1表型由棕榈酰化依赖性机制介导，需要直接酰基-生物素交换、代谢标记、位点特异性突变或棕榈酰蛋白质组学实验加以验证。单细胞定位表明SERPINE1和CTHRC1主要来源于成纤维细胞区室，体组织表达可能反映间质丰度和活化状态，需空间转录组学、双免疫荧光和共培养实验量化各区室贡献。免疫治疗分析和GDSC药物敏感性分析均属探索性关联，不能替代前瞻性治疗反应验证。局限性包括回顾性设计、平台差异、外部预后性能变异、小样本队列、未与竞争性签名进行头对头比较、免疫缺陷异种移植模型无法评估免疫排斥或基质相互作用，以及未进行直接棕榈酰化检测。
结论：SERPINE1/CTHRC1/EGR1评分可识别以较差生存和显著免疫-间质重塑为特征的胃癌亚组，并提供探索性药物基因组学信息。CTHRC1在测试的细胞和异种移植模型中具有促肿瘤作用，而其在患者单细胞数据中主要定位于成纤维细胞，提示间质和上皮来源均需考虑。
