《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Development of a novel organoid-based two-dimensional system to model the intestinal host–parasite interface in fasciolosis
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背景：肝片吸虫（Fasciola hepatica）新脱囊幼虫（FhNEJ）与肠道上皮之间的早期相互作用至今仍知之甚少，部分原因在于缺乏生理相关性良好的体外模型。本研究建立了一种人十二指肠类器官源性上皮单层（organoid-derived epithelia
背景：肝片吸虫（Fasciola hepatica）新脱囊幼虫（FhNEJ）与肠道上皮之间的早期相互作用至今仍知之甚少，部分原因在于缺乏生理相关性良好的体外模型。本研究建立了一种人十二指肠类器官源性上皮单层（organoid-derived epithelial monolayer, ODM）共培养体系，以探究早期宿主-寄生虫界面，从而为分析FhNEJ与肠道上皮之间的相互作用提供一个可控的实验平台。方法：将代表人十二指肠的ODM分别与活FhNEJ或源自寄生虫的被膜富集蛋白组分（tegument-enriched protein fraction, FhNEJ-Teg）进行共培养。随后，该ODM共培养体系被用于评估FhNEJ活力及寄生虫-上皮相互作用，并辅以互补的功能学与分子学读出指标，包括跨上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance, TEER）测量、荧光素通透性测定、细胞间上皮连接的免疫荧光（immunofluorescence analysis, IFA）分析以及定量蛋白质组学分析。结果：ODM–FhNEJ共培养体系能够维持寄生虫的持续活力，并实现了寄生虫与上皮之间紧密相互作用的直接可视化。功能学与结构学分析揭示，暴露于FhNEJ后上皮屏障功能发生障碍；同时，定量蛋白质组学产生了一个探索性分子数据集，鉴定出与上皮连接组织、免疫信号传导、细胞应激及机械传导相关的候选蛋白质。结论：综上所述，这些发现确立了人肠道ODM作为研究肝片吸虫感染最早阶段的生理相关实验平台。通过将功能学、成像及定量蛋白质组学分析整合于单一实验框架内，该模型为生成和检验早期片形吸虫病宿主-寄生虫相互作用相关假说提供了宝贵资源。
**研究背景与存在问题**
肝片吸虫（Fasciola hepatica）是片形吸虫病（fasciolosis）的主要病原体，该病是全球分布最广的食源性吸虫病，在动物和人类中造成数以百万计的感染。人类片形吸虫病被世界卫生组织列为被忽视的热带病，约1.8亿人面临感染风险；近年来三氯苯达唑（triclabendazole, TCBZ）耐药株的不断出现进一步凸显了开发新防治策略的紧迫性。由于肝片吸虫感染造成的大部分组织损伤源于幼虫穿过肠道后的迁移，因此阻止新脱囊幼虫（FhNEJ）穿越肠壁成为减轻病理损伤的关键。然而，FhNEJ穿越肠壁这一早期迁移阶段的分子机制至今仍未阐明，主要原因是缺乏能够准确再现体内环境的生理相关且易于实验操作的体外模型。已有的小鼠小肠原代上皮细胞共培养模型无法完全再现组织的结构、极性和多细胞复杂性；体内及离体动物模型则不能完全反映人体情况，且不符合欧盟3R原则。三维（3D）类器官虽具生理相关性，但许多蠕虫体积过大，难以通过显微注射进入类器官腔。二维（2D）类器官源性上皮单层（ODM）由成体干细胞分化而来，能够忠实再现来源组织的细胞组成及电生理和通透性特性，且顶端面可直接暴露于寄生虫，是研究肠道宿主-寄生虫界面的理想平台。然而，人十二指肠ODM与FhNEJ共培养的适用性此前尚未被探索。
**研究概述**
研究人员建立了人十二指肠ODM–FhNEJ共培养体系，系统评估了该体系在维持寄生虫活力、可视化寄生虫-上皮相互作用以及支持功能学、结构学和分子学读出方面的能力，并利用该平台初步探讨了活虫及虫体被膜蛋白刺激下的肠上皮屏障反应。
**主要技术方法**
本研究使用来自单一健康人供体的人十二指肠3D类器官（按Holthaus等人2022年方案建立），经消化后以5×10
5活细胞接种于包被Cultrex基底膜提取物的聚碳酸酯膜transwell小室（0.6 cm2，0.4 μm孔径），分化11–12天形成ODM。肝片吸虫囊蚴（意大利株，Ridgeway Research Ltd）经体外脱囊获得FhNEJ，以5或50条活虫或0–50 μg/ml的被膜富集蛋白组分（FhNEJ-Teg）刺激ODM。检测手段包括跨上皮电阻（TEER）测量、荧光素通透性测定、免疫荧光（IFA）结合共聚焦显微镜、免疫印迹以及基于LC-MS/MS（diaPASEF模式）的定量蛋白质组学分析。共进行3次独立实验，每次使用连续传代的ODM和独立亚批囊蚴。
**研究结果**
**2.1 人十二指肠ODM–FhNEJ共培养模型的建立**
通过标准流程将人十二指肠3D类器官分化培养为ODM，于播种后第11–12天加入新鲜脱囊的FhNEJ。活细胞延时成像显示FhNEJ在加入后至少48小时内保持存活和高运动性。IFA结合共聚焦显微镜直接观察到FhNEJ通过腹吸盘稳定附着于肠上皮表面；值得注意的是，少量FhNEJ（每transwell 1–3条，共加入50条）位于上皮层下方，但其腹吸盘仍与上皮细胞保持直接接触，表明该模型能够捕捉寄生虫相对于上皮的位置信息，为未来研究寄生虫穿越肠壁的机制奠定了基础。
**2.2 应用ODM共培养模型研究活FhNEJ刺激下的上皮反应**
ODM在11–12天时形成稳定的功能性屏障。加入FhNEJ后，TEER呈剂量和时间依赖性下降，且50条FhNEJ组的下降更为显著；荧光素通透性测定显示通透性增加与寄生虫数量成正比。显微镜检查发现50条FhNEJ组出现上皮单层自transwell膜边缘部分脱离。免疫荧光分析显示50条FhNEJ处理组上皮细胞顶端域的紧密连接蛋白ZO-1信号显著减弱，免疫印迹检测到ZO-1总丰度出现中等但显著的降低；而CLDN-1在紧密连接的定位基本保持完整，仅丰度略有下降。上述功能学与结构学互补结果表明该共培养体系可支持多种读出指标来评估上皮屏障完整性。
**2.3 应用ODM共培养模型研究FhNEJ表面表达蛋白刺激下的上皮反应**
以不同浓度（0–50 μg/ml）FhNEJ-Teg刺激ODM后，TEER维持生理水平，紧密连接蛋白ZO-1、CLDN-1和CLDN-2的表达与分布均未发生可检测的改变。这表明单独的表面表达分子不足以再现活虫引起的屏障功能障碍，提示活虫分泌产物和/或直接物理接触可能参与屏障破坏过程。
**2.4 ODM–FhNEJ共培养体系与定量蛋白质组学分析的兼容性**
对对照组及5条或50条FhNEJ共培养组的全细胞裂解液进行定量蛋白质组学分析，共鉴定6,827个蛋白质（假阳性率FDR≤1%）。差异表达分析分别鉴定出26个（5条FhNEJ）和77个（50条FhNEJ）差异丰度蛋白（DEPs），其中17个在两组间重叠，且大多数DEPs丰度升高，仅4个在50条FhNEJ组中降低。候选蛋白包括上皮连接相关蛋白（claudin-7, CLDN7；nectin-1, NECTIN1）、免疫信号分子（诱导性T细胞共刺激配体ICOSL、转化生长因子β受体2 TGFBR2、三结构域蛋白59 TRIM59）、细胞应激相关蛋白（热休克同源71 kDa蛋白HSPA8/HSC70）以及机械传导相关蛋白（TEA
