《Frontiers in Marine Science》：Mangrove-derived marine actinobacteria as sustainable biostimulants: exploring functional diversity and plant growth promotion in paddy (Oryza sativa)
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红树林生态系统代表了尚未充分开发的放线菌资源，这些放线菌在可持续农业应用中具有潜力。本研究评估了从三个红树林生态系统中分离的可培养放线菌的多样性、植物促生特性、次生代谢产物谱及生物刺激素潜力。共分离到28株菌株，并对其进行了吲哚-3-乙酸（IAA）和铁载体产生
红树林生态系统代表了尚未充分开发的放线菌资源，这些放线菌在可持续农业应用中具有潜力。本研究评估了从三个红树林生态系统中分离的可培养放线菌的多样性、植物促生特性、次生代谢产物谱及生物刺激素潜力。共分离到28株菌株，并对其进行了吲哚-3-乙酸（IAA）和铁载体产生、固氮以及矿物溶解活性的筛选。其中，18株菌株产生IAA和铁载体，13株表现出固氮能力，6株溶解锌，4株溶解钾和磷酸盐。基于其多功能特性，研究人员选取了六株菌株（Streptomyces sp. VITMSS1、Actinopolyspora sp. VITMSS2、Phytoactinopolyspora sp. VITMSS8、Corynebacterium sp. VITMSS15、Brevibacterium sp. VITMSS18和Streptomyces sp. VITMSS26）来配制微生物生物刺激素联合菌群。次生代谢物谱分析鉴定出24种与抗菌、抗真菌及植物促生活性相关的代谢物。研究人员采用卷纸法、育苗盘法和盆栽试验，在20%–100%浓度下于水稻（Oryza sativa cv CO51）上对该联合菌群进行了评估。40%浓度的联合菌群处理持续显示出对植株生长、生物量和产量的最大提升效果，而更高浓度则导致矮化和生长抑制。比较二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）分析揭示了与生长素和茉莉酸生物合成以及非生物和氧化胁迫响应相关蛋白的表达增强，这为观察到的生物刺激效应提供了分子层面的支持。总体而言，这些发现证明了红树林源放线菌作为多功能微生物资源库的潜力，并确立了所配制的联合菌群——尤其是40%浓度——作为一种用于可持续水稻生产的极具前景的微生物生物刺激素。
研究背景与科学问题
水稻（Oryza sativa）是全球半数人口的主要粮食作物，印度作为最大的水稻生产国，其种植面积约4400万公顷，贡献了约20%的国内生产总值（GDP）。然而，传统水稻种植高度依赖化肥和化学农药，这不仅增加了生产成本，还导致了严重的环境问题：养分淋溶引发水体富营养化、土壤酸化、微生物群落破坏、地下水污染、土壤板结及持水能力下降。此外，大量施用氮肥还会加剧温室气体（如N2O）排放。同时，稻田的静水微气候易诱发病虫害，迫使农民依赖化学农药，这不仅杀灭有益昆虫和线虫，还导致害虫抗药性增加，迫使农民加大用药剂量，形成恶性循环。残留农药还会通过食物链对人类和牲畜构成健康风险。因此，亟需开发能够维持或提高作物产量、同时减少对合成农用化学品依赖的可持续农业策略。
虽然已有多种微生物（如Rhizobium、Azospirillum、Bacillus等）被证实具有植物促生（PGP）特性，但这些微生物在多变的环境（如极端pH、波动盐度、不同土壤质地和严格微好氧条件）下的存活、定殖及功能稳定性仍存疑。为此，研究人员将目光转向能够在极端环境中生存且具有强大生物勘探潜力的微生物。放线菌因其显著的代谢多样性、对环境波动的耐受性以及合成广泛生物活性代谢物的能力而备受关注。特别是红树林相关的放线菌，它们能够适应波动的盐度、强烈的太阳辐射、潮汐淹没和缺氧环境，并在此过程中进化出特殊的代谢和生理适应性。然而，印度东南沿海多个红树林生态系统（如Palk Strait区域的Pathanendal、Karankadu和Muthukuda）中可培养放线菌的多样性和功能潜力尚未得到系统评估。本研究旨在填补这一知识空白，通过整合多样性评估、功能筛选、菌群配制、次生代谢物分析和植株验证，系统发掘红树林源放线菌作为多功能微生物生物刺激素的潜力。
主要关键技术方法
- 1.
样品采集与预处理：研究人员从印度Tamil Nadu海岸Palk Strait区域的三个红树林位点（Pathanendal、Karankadu、Muthukuda）采集沉积物样品，采样深度约10 cm，每份约500 g，低温运输并于4°C保存。采用复合取样法将每份位点的两个样品混合均一化。
- 2.
放线菌选择性分离：样品经CaCO3和酵母提取物预处理后，于55°C加热10分钟，梯度稀释至10-5，涂布于模拟不同理化性质（NaCl浓度6%-18%、pH 3/5/9、温度10°C/27°C/45°C）的淀粉酪蛋白琼脂培养基上进行选择性分离。
- 3.
多相分类与分子鉴定：通过形态学观察（包括扫描电子显微镜SEM）、生化测定（蛋白酶、脲酶、淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶等胞外酶活性）及16S rDNA基因测序（使用放线菌特异性引物243F/A3R）进行菌株鉴定，并利用邻接法（Neighbour-Joining）构建系统发育树。
- 4.
植物促生（PGP）性状体外评价：分别采用Jensen无氮培养基（奈斯勒试剂显色法）检测固氮能力、CAS法检测铁载体产量、Salkowski比色法检测IAA产量、Pikovskaya培养基检测磷酸盐溶解、Aleksandrow培养基检测钾溶解、含ZnO培养基检测锌溶解，并对阳性菌株进行定量分析。
- 5.
菌株相容性与生物刺激素联合菌群配制：采用交叉划线法测试菌株间拮抗作用，将相容的多功能菌株分别在胰蛋白胨大豆肉汤中培养至1.5×108 CFU/mL后等体积混合制备联合菌群。
- 6.
次生代谢物提取与分析：将联合菌群接种于含6% NaCl和0.3% KNO3的淀粉酪蛋白肉汤中发酵10天，用乙酸乙酯萃取后通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行代谢物鉴定。
- 7.
植物促生效果评估：通过卷纸法（rag-doll）、育苗盘（protray）和盆栽试验，设置20%-100%五个联合菌群浓度梯度及化学肥料对照、商品生物肥料对照和空白对照，系统评估对水稻品种CO51的生长、生物量和产量影响。
- 8.
蛋白质表达分析：提取对照组和最优处理组水稻叶鞘总蛋白，进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE），差异表达蛋白斑点经胰蛋白酶消化后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）鉴定。
研究结果
3.1 放线菌的分离
从三个红树林位点共分离到28株放线菌菌株，其中Pathanendal 11株、Karankadu 9株、Muthukuda 8株。各采样点沉积物理化性质存在差异：Pathanendal呈碱性（pH 8）、高电导率、高K/Ca/Mg/S/Fe/Cu/交换性Na含量；Karankadu电导率较低但硝酸盐-N、Mn、Fe、Cu、Mg和Na含量较高；Muthukuda pH最低（6.96），电导率高，硝酸盐-N、Ca、Mg、Na和有效S含量高，而Mn、Fe、Cu含量最低。
3.2 放线菌分离株的形态与生理特征
多数菌株具有耐盐性，NaCl耐受范围6%-21%。Pathanendal的11株中9株耐盐、1株耐碱、1株耐热；Karankadu的9株中8株耐盐、1株耐碱；Muthukuda的8株中5株耐盐、2株耐酸、2株耐碱。多数分离株产孢子、气生和基内菌丝，部分产色素。
3.3 多样性分析
16S rRNA基因测序显示所有菌株序列同源性>97%，查询覆盖率100%。Pathanendal群落多样性最高，以Streptomyces和Phytoactinopolyspora为主，其次为Actinopolyspora、Brevibacterium、Corynebacterium、Jiangella、Nesterenkonia、Nocardiopsis和Prauserella。Karankadu以Streptomyces占主导，另有Actinopolyspora、Prauserella、Corynebacterium、Brevibacterium、Micrococcus和Phytoactinopolyspora。Muthukuda分布较均匀，包含Brevibacterium、Phytoactinopolyspora、Prauserella、Actinopolyspora、Nesterenkonia、Streptomyces及一株未鉴定海洋放线菌。α多样性分析表明Pathanendal具有最高的物种丰富度（S=9）、香农-维纳指数（H′=2.15）和逆辛普森指数（1/D=8.07），而皮洛均匀度（J′=0.97-0.98）在所有位点均很高。
3.4 体外PGP性状
28株菌株中，18株产生IAA和铁载体，13株具固氮能力，6株溶解锌，4株溶解磷和钾。基于定性筛选结果，选取6株多功能菌株（Streptomyces sp. VITMSS1、Actinopolyspora sp. VITMSS2、Phytoactinopolyspora sp. VITMSS8、Corynebacterium sp. VITMSS15、Brevibacterium sp. VITMSS18、Streptomyces sp. VITMSS26）进行定量分析。定量结果显示：固氮能力以VITMSS8最高（42 μg/mL），其次为VITMSS26（39 μg/mL）和VITMSS2（36 μg/mL）；IAA产量以VITMSS18最高（7.2 μg/mL）；铁载体产量以VITMSS8（77%）和VITMSS18（72%）最高；磷溶解仅VITMSS2（19 μg/mL）和VITMSS8（15 μg/mL）具备；钾溶解以VITMSS26（28 μg/mL）和VITMSS2（26 μg/mL）最强；锌溶解以VITMSS15（28 μg/mL）和VITMSS8（21 μg/mL）最有效。
3.5 植物促生效果评估
卷纸法、育苗盘和盆栽试验一致表明，40%浓度的联合菌群处理（T2，6.0×107 CFU/mL）在水稻根长、芽长、鲜重、干重及产量参数上均表现最佳，显著优于化学肥料（T6）和商品生物肥料（T7）对照。而60%及以上浓度处理（T3-T5）导致生长抑制和矮化现象，表明存在浓度依赖性效应。
3.6 蛋白质表达分析
2D-PAGE结合MALDI-TOF分析显示，与对照组相比，40%联合菌群处理的水稻叶片中与生长素和茉莉酸生物合成、非生物胁迫和氧化胁迫响应相关的蛋白表达上调，为观察到的生物刺激效应提供了分子证据。
总结与讨论
本研究成功从三个先前未被充分研究的红树林生态系统中分离并鉴定了28株放线菌，系统评估了其植物促生（PGP）性状，并基于功能互补性和菌株相容性，筛选出6株高效菌株配制了微生物生物刺激素联合菌群。该联合菌群的次生代谢物谱鉴定出24种具有抗菌、抗真菌和促生活性的代谢物。通过卷纸法、育苗盘和盆栽三级验证体系，研究人员明确了40%（6.0×107 CFU/mL）为最佳应用浓度，该浓度处理能显著促进水稻生长、提高生物量和产量，而更高浓度则产生抑制作用，提示实际应用中需精准控制用量。蛋白质组学分析进一步揭示了该联合菌群通过激活生长素/茉莉酸信号通路及增强胁迫响应蛋白表达来发挥促生作用的分子机制。本研究的创新之处在于将红树林放线菌多样性评估、功能性PGP筛选、菌株选择、联合菌群配制、次生代谢物分析和植株水平验证整合在一个实验框架内，建立了从环境微生物资源发现到农业应用的转化桥梁。
研究结论翻译：总体而言，这些发现证明了红树林源放线菌作为多功能微生物资源库的潜力，并确立了所配制的联合菌群——尤其是40%浓度——作为一种用于可持续水稻生产的极具前景的微生物生物刺激素。
