多队列转录组证据揭示致死性脓毒症中焦亡与坏死性凋亡程序相对抑制及铁死亡特征富集

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Relative suppression of pyroptosis- and necroptosis-related transcriptional programs and enrichment of ferroptosis-related signatures are associated with fatal sepsis: multi-cohort bulk and single-cell transcriptomic evidence

　　

背景：脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的综合征，仍是危重患者死亡的主要原因。多种形式的程序性细胞死亡（PCD）可能参与免疫失调和器官损伤，但其在不同疾病严重程度和结局中的转录模式尚未完全阐明。

方法：研究人员对五个公共脓毒症队列进行了整合转录组分析，包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE167363和GSE151263，以及三个批量转录组队列。主要结局分析侧重于队列定义的致死性脓毒症（GSE65682中的28天非幸存者和GSE63042中的脓毒症死亡组），而肺炎/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）比较作为次要探索性分析。研究人员在临床分组和免疫细胞群体中评估了PCD相关转录程序。进一步通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7和THP-1细胞中评估了六个候选基因，作为靶向体外转录验证。

结果：在GSE65682中，28天非幸存者表现出较低的焦亡、坏死性凋亡和凋亡程序评分，但铁死亡评分高于幸存者，且较高的焦亡评分与较好的28天生存率相关。GSE154918则显示从健康对照到感染/脓毒症组PCD相关程序评分广泛升高，反映了疾病-对照对比而非结局对比。在LPS模型中，CASP1、RIPK3和NLRP3上调，而SIRT1、BCL2和HIF1A下调。这些细胞实验评估了急性炎症转录反应性，并非旨在重现患者队列中观察到的死亡率相关方向。

结论：多队列分析确定了脓毒症中与结局相关的PCD转录模式，包括非幸存者中焦亡和坏死性凋亡相关程序的相对抑制及铁死亡相关特征的富集。LPS实验提供了补充性mRNA水平证据，表明选定的PCD基因对炎症刺激具有转录反应性，但不构成致死性脓毒症特征的方向性或功能性验证。仍需要进行功能性和前瞻性临床验证。

脓毒症是由宿主对感染反应失调引起的危及生命的综合征，是重症监护病房（ICU）患者死亡的主要原因，全球每年相关死亡人数超过1100万，占全因死亡的约20%。尽管抗微生物治疗和血流动力学支持不断进步，但靶向干预仍不足，其根源在于脓毒症的分子机制极其复杂，涉及多种重叠且交互作用的程序性细胞死亡（PCD）形式。既往研究已表明焦亡、坏死性凋亡和铁死亡等非凋亡性死亡方式参与免疫功能障碍和组织损伤，但PCD相关转录程序如何随免疫细胞谱系、疾病阶段和临床结局变化仍不明确；且转录丰度本身不能确定这些死亡通路的实际执行。因此，研究人员开展了一项整合性转录组分析，以确定幸存者与非幸存者之间PCD相关转录程序是否存在差异，以及这些结局相关模式是否能在独立批量转录组队列中重复，并通过单细胞测序（scRNA-seq）将信号定位至免疫细胞群体，利用RT-qPCR验证候选基因的炎症转录反应性。

研究人员整合分析了五个公共转录组队列：两个scRNA-seq数据集GSE167363（外周血单个核细胞，含健康对照和革兰阴性脓毒症患者）和GSE151263（肺炎相关脓毒症，含脓毒症合并ARDS），以及三个批量转录组队列GSE63042、GSE65682和GSE154918。主要结局分析聚焦GSE65682中的28天非幸存者（n=114）对比幸存者（n=365），以及GSE63042中的脓毒症死亡组（n=28）对比幸存者（n=78）。研究发现：在GSE65682中，28天非幸存者的焦亡、坏死性凋亡和凋亡程序评分较低，而铁死亡评分较高；高焦亡评分与较好的28天生存率相关。GSE154918则显示从健康对照到感染/脓毒症组PCD相关评分普遍升高，反映了疾病-对照对比而非结局对比。单细胞分析显示焦亡和铁死亡信号在CD14+和CD16+单核细胞中最突出。RT-qPCR实验表明，LPS刺激后CASP1、RIPK3和NLRP3表达上调，SIRT1、BCL2和HIF1A表达下调，但这些实验只反映急性炎症转录反应性，而非对致死性脓毒症特征的方向性验证。该研究的意义在于：在程序/通路水平上识别出可重复的结局相关PCD转录模式，为后续功能性研究和预后标志物开发提供了候选靶点。

主要技术方法：研究人员利用五个公共GEO队列（GSE167363、GSE151263、GSE63042、GSE65682、GSE154918），其中GSE167363和GSE151263为PBMC scRNA-seq数据，GSE63042和GSE154918为RNA-seq数据，GSE65682为Affymetrix芯片数据。批量数据处理包括log₂标准化、Welch t检验和Benjamini–Hochberg校正；PCD程序评分采用KEGG和文献来源基因集的z-score均值；生存分析采用Kaplan-Meier/log-rank检验和Cox比例风险模型；单细胞数据经QC、归一化、聚类和注释后计算细胞水平程序评分，并构建患者水平pseudobulk进行对比；通路分析采用EnrichR和基因集富集分析（GSEA）；RT-qPCR使用LPS刺激的RAW264.7和THP-1细胞。

队列概览与核心PCD基因景观：通过五个队列共1035个批量样本和19个scRNA-seq文库（QC后83194个细胞）的分析，核心PCD基因在不同严重程度和结局组中呈现差异化表达，如GSE63042中GSDMD、BCL2、GPX4和SIRT1在脓毒症死亡组最低，而HMGB1和HIF1A最高。脓毒症转录组特征以广泛免疫重编程为主：GSE63042脓毒症对比SIRS仅16个显著基因（均为上调），而GSE154918脓毒症/脓毒性休克对比健康对照有4562个显著基因，提示疾病-对照对比与结局对比的生物学差异。结局相关PCD程序：在GSE65682中，28天非幸存者焦亡、坏死性凋亡和凋亡评分较低而铁死亡评分较高；Kaplan-Meier分析显示高焦亡评分者28天生存率更高（85.6% vs 66.2%，log-rank P=2.7e-05）；GSE63042中脓毒症死亡组GSDMD和IL1B下调；GSE154918则显示疾病组PCD评分相对健康对照升高，说明PCD程序在感染/脓毒症中被广泛诱导，但脓毒症内部相对保留焦亡/坏死性凋亡程序与生存相关，而铁死亡富集与致死结局相关。探索性肺炎相关脓毒症和ARDS分析：GSE65682中CAP/HAP脓毒症的铁死亡评分与非感染危重对照差异未达统计学显著（P=0.077），肺炎亚组内非幸存者与幸存者间无核心PCD基因达FDR<0.05，GSE151263中ARDS与脓毒症细胞高度混合，这些阴性结果为探索性临床背景。单细胞图谱、质控与注释：19个文库整合后获得高质量的细胞类型注释，为后续细胞类型解析提供基础。细胞类型解析的PCD景观与pseudobulk确认：焦亡和铁死亡评分在CD14+和CD16+单核细胞中最高，坏死性凋亡在浆细胞和NK细胞中最突出；GSE167363患者水平pseudobulk显示脓毒症单核细胞中GSDMD上调而NLRP3和IL1B下调，提示通路内基因并非一致变化。脓毒症PCD的通路与网络架构：GSEA显示铁死亡基因集富集于非幸存者（NES=1.85，FDR=0.00626），而焦亡（NES=-1.89，FDR=0.001）和坏死性凋亡（NES=-1.64，FDR=0.00669）富集于幸存者；单细胞共表达网络稀疏，仅S100A8-S100A9相关性较强（r=0.94）。跨平台一致性与多队列一致性：患者水平pseudobulk与GSE63042批量效应显著相关（Spearman rho=0.31，P=5.9e-207）；但无核心PCD基因在两个致死结局队列中同时显著，提示跨队列一致性主要体现在程序/通路水平而非单基因水平。LPS诱导的候选PCD基因转录反应：RT-qPCR显示CASP1、RIPK3和NLRP3在LPS刺激后显著上调，SIRT1、BCL2和HIF1A下调，证实这些基因对急性炎症刺激具有转录反应性，但不代表功能执行。

讨论部分指出，PCD相关转录程序随疾病背景和临床结局而变：从健康对照到感染/脓毒症可观察到PCD程序的广泛参与，但在已确立的脓毒症内部，致死结局与焦亡/坏死性凋亡程序的相对抑制及铁死亡富集相关。单细胞分析将相关信号定位于单核细胞。RT-qPCR实验反映的是急性炎症转录反应性，而不是对临床致死方向的验证。肺炎/ARDS分析作为次要探索性背景，未提供对核心结论的强支持。研究局限性包括队列异质性、小样本单细胞比较、体外模型不能模拟临床复杂性、仅检测mRNA而未检测蛋白激活或细胞死亡执行、缺乏因果实验以及跨队列一致性仅体现在程序水平。未来需要独立生物学重复、原代人细胞、通路特异性蛋白与功能检测、遗传或药理学干预及前瞻性临床验证。结论翻译：总之，这项整合分析在多个脓毒症队列中识别了与背景和结局相关的PCD转录模式。相对于健康对照，感染/脓毒症可广泛参与多个PCD相关程序；但在已确立的脓毒症中，致命结局与焦亡和坏死性凋亡相关转录程序的相对抑制及铁死亡相关特征的富集相关。最强的跨队列一致性出现在程序/通路水平而非单个基因水平。在LPS刺激的RAW264.7和THP-1细胞中的RT-qPCR显示CASP1、RIPK3、NLRP3、SIRT1、BCL2和HIF1A对急性炎症刺激具有转录反应性，但该实验未对致命结局特征进行方向性或功能性验证。这些基因和通路在应用于治疗或预后之前，仍需蛋白质水平、功能性和前瞻性临床验证作为候选生物标志物或调控靶点。