一种高通量血清学检测新策略：鸭新型禽偏肺病毒C亚型（aMPV/C）间接ELISA的建立与评估

《Frontiers in Microbiology》：A comprehensive high-throughput detection strategy: an indirect ELISA for serodetection of the novel aMPV/C in ducks

　　

摘要：引言：禽偏肺病毒C亚型（aMPV/C）是中国再度出现并广泛流行的病原体，可引起产蛋鸭输卵管积液综合征（HFS），给家禽业造成重大经济损失。由于尚无针对aMPV/C的注册疫苗或抗病毒药物，准确诊断和及时淘汰感染鸭仍是主要控制措施，因此迫切需要可靠、有效的检测方法。方法：本研究采用纯化的全病毒新型aMPV/C作为包被抗原，建立了一种用于检测鸭aMPV/C抗体的间接酶联免疫吸附试验（iELISA）。结果：该iELISA的临界值确定为0.258。与针对H5亚型禽流感病毒（H5 AIV）、新城疫病毒（NDV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、巴泰病毒（BTV）、鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）、鸭瘟病毒（DPV）、产蛋下降综合征病毒（EDSV）、番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）抗体阳性的鸭血清均无交叉反应，表明其特异性良好。批内和批间变异系数均小于10%，该iELISA的检测灵敏度可达血清稀释度1:102400。采用所建立的iELISA检测了来自3个鸭品种的216份临床血清样本，其中129份（59.7%）为阳性。该iELISA与间接免疫荧光试验（IFA）的符合率为100%（53/53）。结论：总体上，这种经济有效的iELISA为临床诊断和流行病学监测中aMPV/C抗体的检测提供了可靠工具。

研究背景方面，禽偏肺病毒C亚型（aMPV/C）自2021年以来在中国水禽中重新出现并广泛流行，引起产蛋鸭输卵管积液综合征（HFS），造成显著经济损失。目前尚无针对aMPV/C的注册疫苗或抗病毒药物，因此准确诊断和及时淘汰感染鸭是主要控制措施。然而现有检测手段存在明显局限：病毒分离耗时长且阳性率低，仅为8%（2/25）；分子检测虽然灵敏特异，但aMPV/C的病毒血症期仅持续2至10天，限制了其临床应用；血清学方法中尚无商品化试剂盒用于检测鸭血清中的aMPV/C抗体。基于上述问题，研究人员旨在利用纯化的全病毒新型aMPV/C分离株建立一种适用于鸭血清抗体高通量检测的间接酶联免疫吸附试验（iELISA），为临床诊断和流行病学监测提供可靠工具。

研究人员开展了系统的检测方法建立与验证研究。首先，将实验室保存的aMPV-FJ21株接种Vero细胞并进行全病毒纯化；随后以纯化病毒作为包被抗原，通过棋盘式滴定和单因素优化确定iELISA的最佳工作条件，并确定临界值；进而评价该方法的特异性、重复性和敏感性；最后应用于216份临床鸭血清样本的检测，并与间接免疫荧光试验（IFA）进行平行比较。研究结果显示，所建立的iELISA具有良好的特异性、重复性和高灵敏度，与IFA符合率达100%，能够有效检测鸭群中的aMPV/C抗体。这一方法的建立弥补了鸭源aMPV/C血清学检测工具的空白，为大规模流行病学调查和感染控制提供了实用手段。

在关键技术方法上，研究人员使用了以下主要技术：利用Vero细胞增殖aMPV-FJ21株，经超速离心纯化全病毒颗粒，并通过透射电子显微镜（TEM）和BCA蛋白定量法鉴定纯化抗原；采用棋盘式滴定结合阻断时间、孵育时间、酶标二抗稀释度及TMB显色时间等参数的系统优化以确立iELISA条件；以57份健康鸭阴性血清确定临界值（均值+3倍标准差）；通过检测9种常见鸭病原阳性血清评价特异性，通过批内和批间变异系数评价重复性，通过系列稀释阳性血清评价敏感性；最终用216份临床血清样本（其中136份来自麻鸭、42份来自番鸭、38份来自樱桃谷鸭）验证方法适用性，并以IFA进行符合率比较。

病毒纯化与鉴定方面，研究人员通过超速离心获得纯化的aMPV-FJ21病毒颗粒，电镜观察显示其呈不规则球形和长丝状形态，部分丝状颗粒长约1000纳米，符合aMPV/C形态特征；BCA法测定纯化病毒蛋白浓度为2.05毫克/毫升，表明成功获得完整病毒抗原。

iELISA检测方法的建立方面，通过棋盘式滴定确定最佳包被抗原浓度为4微克/毫升、血清最佳稀释度为1:1600；最佳包被条件为碳酸盐缓冲液（CBS）37摄氏度孵育1小时；封闭条件为10%脱脂奶粉37摄氏度90分钟；血清孵育时间为60分钟；酶标二抗稀释度为1:4000并孵育60分钟；TMB显色时间为20分钟，由此建立了完整的iELISA检测流程。

临界值确定方面，研究人员检测57份健康鸭阴性血清，其OD_450nm均值0.123，标准差0.045，按均值加3倍标准差计算，临界值定为0.258。待检样本OD_450nm值大于或等于0.258判定为aMPV/C抗体阳性，低于该值判定为阴性。

特异性、重复性与敏感性方面，特异性试验显示，仅aMPV/C阳性血清呈阳性反应，与H5 AIV、NDV、EDSV、DTMUV、DPV、BTV、MDPV、GPV和DHAV-3等9种常见鸭病原阳性血清均无交叉反应，说明该方法特异性强。重复性试验中，批内变异系数范围为1.42%至4.48%，批间变异系数范围为1.28%至6.74%，均低于10%，表明重复性良好。敏感性试验采用3份aMPV/C阳性血清进行2倍系列稀释，最高阳性稀释度达到1:102400，证明该iELISA灵敏度高。

临床血清样本检测方面，应用建立的iELISA检测216份临床鸭血清，总体阳性率为59.7%（129/216）。其中麻鸭阳性率最高，为69.1%（94/136），番鸭为57.1%（24/42），樱桃谷鸭为28.9%（11/38）。随机选取的53份样本经IFA平行检测，45份阳性、8份阴性，两种方法符合率为100%（53/53），进一步验证了该iELISA用于临床诊断的可靠性。

讨论部分指出，aMPV/C在中国鸭群中的流行病学地位正在发生变化，新型谱系可引起生殖道病变而非典型呼吸道症状，凸显了快速诊断工具的必要性。与重组蛋白包被抗原相比，全病毒抗原保留了天然构象和线性表位，有助于提高低滴度样本的检出能力。研究建立的iELISA在特异性、敏感性和重复性方面均表现良好，且与IFA高度一致，适合替代IFA用于大规模血清学监测。不同鸭品种间阳性率的差异可能与品种易感性、饲养管理或环境暴露有关，值得进一步研究。结论部分指出，研究人员建立了一种灵敏、特异且可重复的iELISA用于检测鸭血清中的aMPV/C抗体，与IFA符合率为100%。该方法为大规模血清学监测提供了实用工具。鸭群中广泛的血清阳性凸显了迫切需要制定疫苗接种策略并开展常规监测，以减轻aMPV/C对中国养鸭业的影响。