《Frontiers in Immunology》：Circulating Cit-H3 and MPO-DNA complexes reveal divergent neutrophil-associated immune profiles in multiple myeloma
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摘要专业翻译
引言： 中性粒细胞（neutrophils）日益被认为是肿瘤炎症和免疫重塑的动态调节因子。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）相关生物标志物已被认为与肿瘤进展有关，但其临床和免疫学解读仍具挑战
摘要专业翻译
引言： 中性粒细胞（neutrophils）日益被认为是肿瘤炎症和免疫重塑的动态调节因子。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）相关生物标志物已被认为与肿瘤进展有关，但其临床和免疫学解读仍具挑战性，因为不同的循环NET组分可能并不代表等效的生物学过程。在多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）——一种由克隆性浆细胞、造血功能与骨髓免疫微环境之间复杂相互作用塑造的恶性肿瘤——中，不同循环NET相关标志物的临床意义仍不明确。
方法： 研究人员检测了171例多发性骨髓瘤患者和15例健康对照者血清中的瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，Cit-H3）和髓过氧化物酶-DNA复合物（myeloperoxidase-DNA complexes，MPO-DNA）。患者根据采血时的疾病状态分为新诊断多发性骨髓瘤、缓解期或复发/难治性多发性骨髓瘤。研究人员分析了上述标志物与疾病状态、炎症参数、肿瘤负荷、血液学指标、R-ISS和R2-ISS分期、高危细胞遗传学异常及探索性生存结局之间的关联。
结果： 多发性骨髓瘤患者血清Cit-H3水平显著高于健康对照者，且在复发/难治性疾病中最高。Cit-H3与较低淋巴细胞计数和较高中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）相关。相比之下，血清MPO-DNA复合物水平在总体骨髓瘤队列中较对照组无显著升高，且在复发/难治性疾病中低于新诊断或缓解状态。在探索性相关分析中，较高MPO-DNA水平与较高血红蛋白和白蛋白水平、较低骨髓浆细胞负荷及较低β2-微球蛋白相关。Cit-H3和MPO-DNA水平无显著相关性，且两者均与R-ISS或R2-ISS分期、del(17p)、t(4;14)或1q21扩增无显著关联。探索性生存分析显示两者与无进展生存期或总生存期均无统计学显著关联。
讨论： 循环Cit-H3和MPO-DNA复合物在多发性骨髓瘤中并非可互换的NET相关生物标志物，也不单纯反映常规临床或细胞遗传学风险分层。这些标志物并非代表统一的NET信号，而可能捕捉了中性粒细胞相关免疫失调、系统性炎症和造血状态的不同方面，凸显了前瞻性验证的必要性。
论文解读
一、研究背景与目的
多发性骨髓瘤是一种以骨髓中浆细胞克隆性扩增及局部和全身免疫环境深刻重塑为特征的不可治愈的血液系统恶性肿瘤。尽管新型治疗药物显著延长了患者生存期，复发仍是重大挑战，提示骨髓瘤的生物学复杂性以及免疫和微环境因素在疾病演变中的重要性。当前分期和风险分层主要聚焦于恶性浆细胞的内在特征，如细胞遗传学图谱。然而，越来越多的证据表明，肿瘤微环境中的非恶性组分也参与疾病进展、免疫逃逸和治疗耐药。
在肿瘤微环境的多种组分中，中性粒细胞传统上受到的关注较少。但目前中性粒细胞已被认识到是癌症中高度异质和可塑的细胞，而非均一的效应细胞群体。根据疾病状态、系统性炎症信号、肿瘤负荷和治疗暴露的不同，中性粒细胞可能获得与免疫抑制、组织重塑、血栓形成、血管生成或抗肿瘤活性相关的多种功能状态。因此，中性粒细胞相关生物标志物可能为癌症患者的系统性免疫状态提供额外见解。
中性粒细胞活化的一个标志是中性粒细胞胞外诱捕网的形成。NETs是由染色质、组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白组成的细胞外结构。在癌症中，NETs已被认为与肿瘤炎症、免疫逃逸、血栓形成和治疗耐药有关。然而，将NET生物学转化为临床可解读的生物标志物仍然困难。循环NET标志物具有异质性，在细胞来源、释放机制、胞外稳定性、降解和清除方面可能存在差异。因此，单个NET生物标志物可能不可互换，特别是在血液系统恶性肿瘤等复杂临床情境中。
尽管瓜氨酸化组蛋白H3和髓过氧化物酶-DNA复合物都是广泛使用的循环NET相关标志物，但它们反映NET生物学的不同分子侧面。Cit-H3与PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化和染色质解凝相关，而MPO-DNA复合物反映中性粒细胞颗粒蛋白与胞外DNA之间的结合。尽管NETs在癌症免疫中备受关注，但不同循环NET相关生物标志物在多发性骨髓瘤中的临床和免疫学意义仍不明确。尚不清楚Cit-H3和MPO-DNA复合物在疾病状态间是否呈现相似模式，或者它们是否反映不同的免疫炎症或造血特征。本研究旨在确定这两种循环NET相关标志物在多发性骨髓瘤中是否代表重叠或分歧的中性粒细胞相关免疫特征。
二、研究设计与关键方法
本研究为武汉协和医院开展的单中心、回顾性观察研究。2019年至2023年间共纳入186名参与者，包括171例多发性骨髓瘤患者和15例健康对照者。MM队列根据采血时的疾病状态分为三个亚组：新诊断MM（NDMM，n=82）、复发/难治性MM（RRMM，n=39）以及达到非常好的部分缓解或完全缓解的患者（Remission，n=50）。NDMM样本在诊断时、启动系统性抗骨髓瘤治疗前采集；缓解期样本在常规随访中从达到IMWG缓解标准的患者采集；RRMM定义为既往抗骨髓瘤治疗后经IMWG标准和主治医师评估确认的复发或疾病进展。
研究人员采用两种ELISA方法定量检测血清NET相关标志物。MPO-DNA复合物采用基于抗MPO单克隆抗体包被和过氧化物酶标记抗DNA抗体检测的捕获ELISA，结果以OD405任意单位表示。Cit-H3采用商品化瓜氨酸化组蛋白H3（克隆11D3）ELISA试剂盒定量，吸光度在450 nm读取。所有样本均重复测定取均值，不同疾病组样本分布在不同板孔以最小化批次效应。临床数据从电子病历提取，包括R-ISS分期、骨髓浆细胞百分比、全血细胞计数、CRP、肝功能指标、肾功能指标、β2-微球蛋白、校正钙和LDH等。高危细胞遗传学异常通过骨髓样本FISH检测评估。统计分析采用GraphPad Prism 9和R软件，包括Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验、Spearman秩相关分析、Benjamini-Hochberg FDR校正、多变量线性回归以及Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归。
三、研究结果
3.1 基线特征
三组MM患者（NDMM、缓解期、RRMM）的年龄和性别分布相当。疾病相关参数如骨髓浆细胞负荷、血红蛋白、血小板计数、受累/非受累游离轻链比值、β2-微球蛋白、白蛋白、校正钙和eGFR在疾病状态间存在差异。淋巴细胞计数、CRP和LDH等实验室参数也在组间存在差异。
3.2 疾病分期特异性循环NET相关生物标志物动态
血清Cit-H3水平在MM患者中显著高于健康对照者（总体MM vs 对照，p<0.001）。中位数（IQR）血清Cit-H3水平在对照者为0.173（0.167，0.186），NDMM为0.371（0.230，0.733），缓解期为0.476（0.274，0.695），RRMM为0.882（0.551，1.192）。RRMM组Cit-H3最高，显著高于NDMM和缓解期组（均p<0.001），NDMM与缓解期之间无显著差异。相比之下，血清MPO-DNA水平在总体MM人群与健康对照之间无差异。中位数（IQR）血清MPO-DNA水平在对照者为0.949（0.745，1.329），NDMM为0.738（0.559，1.018），缓解期为0.884（0.709，1.126），RRMM为0.579（0.460，0.787）。MPO-DNA模式与Cit-H3相反：RRMM组显著低于NDMM和缓解期组（RRMM vs NDMM，p=0.007；RRMM vs Remission，p<0.001）。排除CRP>10 mg/L患者后的敏感性分析显示，Cit-H3在RRMM中仍显著升高，MPO-DNA在RRMM中仍显著低于缓解期患者。
3.3 Cit-H3和MPO-DNA复合物代表非重叠的循环NET特征
在整个MM患者队列中，血清Cit-H3和MPO-DNA水平无显著相关性（Spearman rho=0.059，p=0.460）。这种缺乏关联表明Cit-H3和MPO-DNA可能反映中性粒细胞活化和NETosis动力学的不同方面，可能提供互补而非冗余的信息。
3.4 Cit-H3和MPO-DNA复合物的不同免疫炎症和血液学关联
Spearman相关分析显示两种标志物具有不同的临床特征。Cit-H3主要与炎症和免疫参数相关：与绝对淋巴细胞计数呈负相关（rho=-0.307，p<0.001，q=0.016），与NLR呈正相关（rho=0.256，p=0.003，q=0.024），符合系统性炎症表型。MPO-DNA则与造血功能和疾病负荷标志物广泛相关：与白细胞计数（rho=0.296，p<0.001，q=0.004）、中性粒细胞计数（rho=0.310，p<0.001，q=0.004）、血红蛋白（rho=0.286，p<0.001，q=0.004）和白蛋白（rho=0.187，p=0.017，q=0.039）正相关，与骨髓浆细胞百分比（形态学：rho=-0.370，p<0.001，q=0.004；流式：rho=-0.332，p=0.002，q=0.006）和β2-微球蛋白（rho=-0.190，p=0.022，q=0.044）负相关。分层分析显示，MPO-DNA在非贫血患者（血红蛋白≥90 g/L，p=0.001）和白蛋白正常患者（≥35 g/L，p=0.033）中显著较高；Cit-H3在淋巴细胞减少症患者（淋巴细胞<1.0×109/L，p=0.002）和NLR≥3患者（p=0.003）中显著升高。多变量线性回归分析显示，在校正疾病状态后，中性粒细胞计数与MPO-DNA无显著独立关联（B=0.022，95% CI -0.010至0.053，标准化β=0.098，p=0.184），而RRMM组MPO-DNA水平显著低于NDMM组（B=-0.292，95% CI -0.461至-0.122，标准化β=-0.267，p=0.001）。
3.5 循环NET相关标志物与临床风险分层或高危细胞遗传学异常无关联
在NDMM患者中，R-ISS分期与Cit-H3（p=0.230）或MPO-DNA（p=0.486）均无显著相关，R2-ISS分期与两者也无显著相关。高危细胞遗传学异常方面，del(17p)、t(4;14)和1q21扩增的存在与否均未导致Cit-H3或MPO-DNA水平的显著差异。
3.6 联合NET免疫特征的探索性结局分析
在具有随访数据的NDMM亚组中，基线Cit-H3和MPO-DNA作为连续变量均不是PFS或OS的显著预测因子。按联合NET特征分组的探索性分析中，高MPO-DNA/低Cit-H3组（n=5）显示出最有利的生存趋势，仅发生1例PFS事件，中位PFS未达到；其他组合组（n=33）中位PFS为31个月（26个事件）；低MPO-DNA/高Cit-H3组（n=17）中位PFS为26个月（13个事件），但三组间差异未达统计学显著性（log-rank p=0.141）。OS方面，高MPO-DNA/低Cit-H3组无死亡事件，各组中位OS均未达到，差异无统计学意义（log-rank p=0.603）。
四、讨论与结论
本研究发现两种常用的循环NET相关生物标志物Cit-H3和MPO-DNA复合物在多发性骨髓瘤中呈现分歧的临床和免疫相关特征。Cit-H3在复发/难治性疾病中最高，与淋巴细胞减少和NLR升高相关；而MPO-DNA复合物在复发/难治性疾病中较低，与较好的血液学参数和较低肿瘤负荷相关。这些发现表明循环NET相关生物标志物不应被解读为多发性骨髓瘤中统一的NET信号。
Cit-H3在RRMM中的升高可能反映晚期或治疗耐药疾病中增强的中性粒细胞相关炎症状态。其与较低淋巴细胞计数和较高NLR的关联进一步提示Cit-H3与系统性炎症失衡之间的联系。由于本研究测量的是循环血清标志物，这些发现不应被解读为骨髓内NET沉积增加的直接证据。
较高MPO-DNA水平与较低肿瘤负荷和较好血液学参数的关联出乎意料，如果仅将循环MPO-DNA视为病理性NET形成的标志物的话。一种可能的解释是循环MPO-DNA水平可能受中性粒细胞可用性和造血功能保存的影响。但在校正疾病状态后，中性粒细胞计数与MPO-DNA的关联不再显著，提示疾病状态异质性可能部分解释了观察到的未校正关联。
Cit-H3与MPO-DNA复合物之间缺乏相关性凸显了NET相关生物标志物研究中的一个重要问题：尽管两者都常被用作NET形成的指标，但它们代表不同的分子组分，可能受释放机制、核酸酶活性、蛋白水解降解、血清稳定性和清除的不同影响。研究结果支持NET相关生物标志物应单独解读而非视为单一生物学过程的可互换测量指标。
研究结论：循环Cit-H3和MPO-DNA复合物在多发性骨髓瘤中呈现分歧的免疫相关特征。Cit-H3与复发/难治性疾病和系统性免疫炎症失衡相关，而MPO-DNA复合物与保存较好的血液学状态和较低肿瘤负荷相关。这些发现表明循环NET相关标志物不可互换，可能捕捉多发性骨髓瘤中中性粒细胞相关免疫扰动的不同方面。需要开展将血清生物标志物、骨髓免疫分析和功能性中性粒细胞检测相结合的前瞻性研究，以阐明NET相关免疫特征在骨髓瘤进展和治疗反应中的作用。
