《Frontiers in Plant Science》：Coordinated epigenomic reprogramming and chromatin-mediated transcriptional regulation during soybean callus development
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引言：愈伤组织形成是一个涉及植物细胞脱分化和再生的基础发育过程。然而，该过程中潜在的表观遗传机制仍知之甚少。方法：本研究整合了时间序列ATAC-seq、ChIP-seq（H3K27ac和H3K27me3）以及转录组数据集，以研究大豆愈伤组织发育过程中染色质介导
引言：愈伤组织形成是一个涉及植物细胞脱分化和再生的基础发育过程。然而，该过程中潜在的表观遗传机制仍知之甚少。方法：本研究整合了时间序列ATAC-seq、ChIP-seq（H3K27ac和H3K27me3）以及转录组数据集，以研究大豆愈伤组织发育过程中染色质介导的转录调控。结果：全基因组图谱鉴定出早期愈伤组织诱导期间发生了广泛的表观遗传重塑，包括与动态转录变化相关的15,740个差异可及区域（DARs）。不同的染色质可及性模式对应于连续的发育程序，包括外植体身份的抑制、激素响应性细胞增殖途径的激活以及后期阶段的应激相关反应。在早期诱导期间，染色质可及性和H3K27ac与转录激活密切相关，而从头开放的染色质区域（OCRs）则与关键发育调控因子的表达升高紧密相关。基序富集和chromVAR分析进一步鉴定了涉及ARF-LBD、ERF、E2F/DP和BES1家族在早期增殖重编程期间的阶段特异性TF基序相关调控特征，随后是愈伤组织维持和胁迫适应期间的WOX和WRKY相关特征。讨论：总之，这些发现表明，大豆愈伤组织形成伴随着层级性的表观遗传重编程，涉及动态染色质重塑和阶段特异性TF基序相关调控特征，为理解植物细胞重编程和改进基于再生的作物生物技术提供了全基因组框架。
研究背景与科学问题
植物组织培养是实现遗传转化、加速育种和基因组编辑改良作物的核心技术，其中愈伤组织作为研究细胞可塑性的经典实验模型，其形成通常由创伤或病原侵染等外部刺激触发，涉及具有细胞全能性的相对未分化细胞的增殖。尽管已有研究揭示了拟南芥和小麦等物种中愈伤组织形成伴随的表观遗传重编程现象，但在大豆中，从愈伤组织诱导到快速增殖再到稳定期的连续发育阶段中，染色质可及性、活性与抑制性组蛋白修饰以及转录程序之间的动态关系尚未被系统阐明。此前研究虽通过高分辨率RNA-seq描绘了大豆愈伤组织的转录景观，但无法解析与这些转录转变相关的染色质调控景观的重组机制。因此，本研究旨在通过整合表观基因组与转录组数据，揭示大豆愈伤组织发育过程中染色质层面的调控动态。
研究方法与技术路线
研究人员选取大豆品种Kwang-an的种子进行外植体制备和愈伤组织诱导，在诱导后第0、4、7、14和28天五个时间点收集样品。关键技术方法包括：利用ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，染色质转座酶可及性测序）绘制全基因组染色质可及性图谱；采用针对H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化）和H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化）抗体的ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）分别检测活性和抑制性组蛋白修饰；结合此前发表的RNA-seq数据进行多组学整合分析。数据分析流程包括使用MACS3进行峰识别、Mfuzz算法对差异可及区域（DARs）进行时间聚类、MEME-AME进行转录因子（TF）基序富集分析、chromVAR推断TF基序关联的染色质可及性活性，并通过整合TF结合位点与表达数据构建基因调控网络（GRN）。
研究结果
3.1 大豆愈伤组织发育过程中的表观基因组动态概述
通过ATAC-seq和ChIP-seq分析，研究人员在全基因组范围内鉴定了61K-155K个开放染色质区域（OCRs）、69K-78K个H3K27ac峰和7K-24K个H3K27me3峰。OCRs主要富集于启动子区（45%）和远端基因间区（35%），且在DAI 7时总数显著增加，伴随基因内OCRs比例上升，表明活跃增殖期发生广泛染色质重塑。主成分分析显示，所有多组学数据集的生物学重复均按发育阶段聚类，其中DAI 0与DAI 4之间的分离最为显著，表明从外植体到愈伤组织的转变伴随广泛的表观基因组和转录组重编程。
3.2 染色质可及性簇定义愈伤组织发育中的转录程序
研究人员从启动子和远端调控区鉴定出15,740个DARs，并将其分为六个时间可及性簇。簇1和2在外植体阶段高可及，随后逐渐降低，富集光合作用和器官成熟相关基因，表明早期脱分化过程中外植体身份程序被逐步抑制。簇4在愈伤生长阶段（DAI 4-7）可及性显著增加，富集生长素和细胞分裂素响应基因、LBD家族基因以及细胞壁重塑和细胞周期进程相关基因，对应早期增殖阶段。簇5的可及性从DAI 4持续升高至稳定期，包含WOX家族基因，与愈伤组织身份维持相关。簇3和6在稳定期可及性增加，富集ABA信号、ROS调节和胁迫防御相关基因，对应晚期胁迫适应程序。
3.3 愈伤组织发育中染色质可及性与基因表达的动态协调
相关性分析显示，OCRs可及性与基因表达在多数簇中呈强正相关（r ≥ 0.7），H3K27ac也表现出正相关，而H3K27me3主要为负相关。将数据分为早期（DAI 0-7）和晚期（DAI 7-28）两个阶段后发现，H3K27ac在早期与基因表达强正相关，但晚期相关性减弱甚至转为负向；H3K27me3在晚期与基因表达呈正相关。同时，H3K27ac与染色质可及性在早期所有簇中均强正相关，但晚期减弱，表明早期诱导阶段存在协调的表观遗传变化，而后期染色质状态趋于稳定。
3.4 早期愈伤组织诱导中的染色质可及性重塑与发育调控因子的转录激活相关
比较DAI 0和DAI 4的ATAC-seq图谱，将OCRs分为激活型、失活型和稳定型三类。与激活型OCRs相关的基因中72.8%表达上调，而与失活型OCRs相关的基因中53.5%表达下调。Group I（激活型OCRs伴表达上调）的基因诱导幅度显著大于稳定型OCRs伴上调的基因，而Group II（失活型OCRs伴表达下调）的变化幅度无显著差异，表明从头染色质开放与转录激活强相关。组蛋白修饰分析显示，H3K27ac相关OCRs和未标记区域保持稳定，而H3K27me3相关和双价区域表现出较高的染色质状态可塑性。GO富集分析表明，Group I富集转录调控、发育过程和细胞代谢等愈伤形成相关通路，包括WOX4、ARF8和IAA14等基因；Group II则富集胁迫响应相关基因如NAC029和WRKY15。
3.5 愈伤组织诱导过程中转录因子结合的时间动态
簇基序富集分析显示，ARF、LBD、ERF、E2F/DP和BES1家族在簇4中特异富集，与早期细胞重编程相关。chromVAR分析进一步揭示，ARF和LBD基序在愈伤生长阶段偏差分数最高，之后逐渐下降；BES1和ERF基序在DAI 28时显著降低；而WOX基序在DAI 14后维持较高活性，WRKY基序在后期活性增加，表明不同TF家族在不同发育阶段发挥阶段性调控作用。
3.6 基因调控网络分析与转录因子与发育程序的时间协调
研究人员选择九个代表性TF（PLT3、WOX11、LBD16、LBD18、E2FC、E2FE、OBP1、NAC071和WIND1）构建GRN。通过FIMO扫描鉴定出25,005个高置信度TF结合位点，保留18,088个启动子关联位点用于网络构建。结果显示，早期TF如PLT3和WOX11的预测靶基因分别在DAI 0和DAI 4达到峰值表达，富集蛋白质生物合成和生长素响应功能；LBD16、LBD18和E2FC的靶基因在DAI 1-7达峰；E2FE、OBP1和NAC071与DAI 4-14达峰的晚表达基因群相关。值得注意的是，WIND1在稳定期表达升高，其预测靶标在八个时间表达簇中分布最均匀（香农熵2.96/3.0），暗示其可能作为连接早期创伤响应与后期增殖维持程序的候选时间协调因子。
讨论与结论
讨论部分指出，大豆愈伤组织形成伴随层级性表观遗传重编程，从DAI 0到DAI 4的转变涉及最广泛的表观基因组和转录组重组。早期诱导阶段，染色质可及性的动态增加与H3K27ac积累和转录激活密切相关，而H3K27me3相关区域表现出较高的可塑性。随着发育推进，组蛋白修饰与转录的直接相关性减弱，表明组蛋白修饰可能在转录重编程启动阶段发挥更重要作用，而后期转录状态的维持可能依赖于其他调控机制。TF基序分析支持了一个顺序模型：ERF和ARF-LBD基序与早期创伤和生长素信号相关，E2F/DP和BES1与增殖阶段相关，WOX和WRKY则与愈伤维持和胁迫适应相关。研究结论部分强调，本研究通过整合染色质可及性、组蛋白修饰和转录组分析，证明愈伤组织形成伴随层级性表观遗传重编程，其中动态染色质可及性变化与早期细胞脱分化和增殖重编程中的转录激活密切相关。从头开放染色质区域的形成为关键发育调控因子和激素响应基因的表达升高提供了条件，而时间性TF基序富集和基序关联染色质可及性变化鉴定了候选的阶段关联调控特征。这些发现为理解植物细胞重编程的染色质介导调控提供了新见解，并为提高大豆再生效率和组织培养性能奠定了分子基础。
