《Frontiers in Antibiotics》：Identification of antibiotic resistance genes in fecal microbiota selected donors during the establishment of a biobank in the south of Brazil
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粪便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是治疗复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostridioides difficile infection，rCDI）的有效疗法，并正被越来越多地探索用于其他与
粪便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是治疗复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostridioides difficile infection，rCDI）的有效疗法，并正被越来越多地探索用于其他与菌群失调相关的疾病。然而，将其作为规范化治疗策略加以实施，需要建立严格的供体筛选、生物安全框架及标准化处理流程。本研究描述了巴西南部首个粪便微生物群生物库的建立过程，并评估了将宏基因组测序（metagenomic sequencing）作为供体特征分析与安全性评估补充层级的可行性。研究人员基于国际指南构建了结构化的供体筛选流程，整合了临床筛查、生化与血清学检测以及微生物学分析。在100名筛选候选人中，仅4名供者满足全部入选标准并被纳入生物库，凸显了筛选过程的严格性。鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）揭示所有供者均携带多样化的耐药基因组（resistome），包括一组共有的核心耐药基因以及显著的个体间差异。主要耐药决定因子包括四环素（tetracycline）相关基因、ermF、CfxA型β-内酰胺酶（CfxA-type β-lactamases）以及氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside-modifying enzymes），这些基因与特定的肠道菌群分类群相关联。基因组背景分析进一步鉴定出4条含有耐药基因（antibiotic resistance gene，ARG）的contig，其特征与潜在移动性相容，但活跃的水平基因转移（horizontal gene transfer）不在本研究范围之内。值得注意的是，tet(Q)和ermF主要与脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）相关联，支持该物种作为肠道菌群中耐药决定因子储库的角色。上述发现支持将宏基因组分析概况分析用作供体特征分析与风险评估的补充手段，而非作为供体排除的独立标准。总体而言，本研究为微生物群生物库的实施提供了框架，并强调了宏基因组分析在补充FMT常规生物安全筛查方面的潜力。
**论文解读：巴西南部粪便微生物群生物库供体筛选中的抗生素耐药基因宏基因组分析**
**一、研究背景与目的**
粪便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）已成为治疗复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostridioides difficile infection，rCDI）的高效疗法，成功率超过90%，并正逐步扩展至炎症性、代谢性及免疫介导性疾病等更广泛的菌群失调相关适应症。然而，FMT所转移的并非单一分子实体，而是一个复杂且动态的微生物生态系统，其组成与功能属性尚未被充分表征。这种固有复杂性给标准化、可追溯性及质量控制带来了严峻挑战，而这些正是开发安全且可规模化治疗产品的基本要求。在此背景下，粪便微生物群生物库与粪便库作为推动FMT走向规范化治疗的关键基础设施应运而生，旨在集中供体招募、确保标准化筛查、实现受控处理与储存，并支持临床材料的全程追溯。然而，不同国家在监管环境、技术能力及临床实践上的差异，导致此类系统的实施仍高度异质。现行供体筛查方案主要聚焦于排除已知病原体和高风险临床状况，虽然不可或缺，但其局限性在于仅针对预设目标，未能全面涵盖供体微生物群的功能与遗传复杂性。随着FMT向新适应症和日益脆弱的患者群体扩展，对更全面的生物安全评估策略的需求愈发迫切。本研究旨在建立巴西南部圣卡塔琳娜州首个粪便微生物群生物库，并探索将宏基因组测序作为安全性评估的补充工具——并非作为确定性排除标准，而是作为拓展基于微生物群疗法质量控制策略的途径。
**二、主要研究方法**
研究人员开展了一项描述性与方法学性研究，分三个阶段实施：基于国际指南开发供体筛查工具；实施临床与实验室供体筛选流程；探索性纳入供体粪便微生物群宏基因组分析。供体招募于2023年7月至9月进行，100名候选人接受临床筛查问卷评估，其中6人通过临床资格审核进入实验室筛查。实验室检测涵盖血液生化、血清学传染病标志物及粪便病原体多重PCR（FilmArray?）检测。合格供体的粪便样本经标准化流程处理后储存于?80°C。宏基因组测序采用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）MinION平台，测序数据经质量控制后，利用耐药基因识别工具（Resistance Gene Identifier，RGI）v6.0.3比对综合抗生素耐药数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）鉴定耐药基因，并通过Flye v2.9.6组装、ABRicate v1.4.0、geNomad v1.12.0、MOB-suite v3.1.9、Bakta v1.9.4及ISEScan v1.7.3等工具分析耐药基因的基因组背景与潜在移动性。所有参与者均签署书面知情同意书，研究经机构审查委员会批准（CAAE: 42603020.0.0000.0121）。
**三、研究结果**
**3.1 供体招募与临床资格**
在100名接受临床筛查问卷评估的候选人中，仅6人符合临床入选标准进入实验室筛查。经生化、血清学及微生物学检测后，又有2名候选人被排除，其中1人因多重PCR检出产毒艰难梭菌（C. difficile），另1人未完成全部实验室筛查流程。最终仅4名参与者被认定为合格供体并纳入生物库。该筛选流程高度严格，与国际上其他生物库项目的供体合格率相符，凸显了结构化、透明且可重复的筛选工作流程在FMT项目中的基石作用。
**3.2 耐药组概况特征**
测序共产出7.09 Gb数据（544万条reads；N50=2.55 kb），read准确率为79.6%~84.7%。宏基因组分析在CARD数据库中鉴定出180种耐药相关基因条目，其中样本1检出137种、样本2检出87种、样本3检出103种、样本4检出134种。仅58种在所有样本中一致检出，122种呈部分分布。按功能分类，100种为典型耐药基因（antibiotic resistance gene，ARG），80种为变异依赖性位点（如rRNA基因、gyrA/parC/parE、rpoB相关位点）。共有基因中仅11种被归类为典型ARG（核心耐药组），包括APH(3’)-IIIa、CfxA2、CfxA3、ErmF、mefA、AlaS及5种四环素耐药决定因子（tet(32)、tet(40)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)）。
**3.3 优势耐药基因的分类分布与丰度**
各样本中均检出一组一致的优势耐药基因，以tet(Q)、tet(W)、tet(O)、ErmF和CfxA2最为突出。tet(Q)主要与脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）相关，tet(W)主要与长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）相关，tet(O)主要与空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）相关，ErmF亦主要归因于脆弱拟杆菌，而CfxA2则与中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）相关联。各样本的优势基因比例丰度差异显著：样本1以tet(Q)为主导（占ARG丰度的34.3%）；样本2呈较均匀分布；样本3组成更为均衡；样本4则tet(Q)优势减弱，tet(W)和ANT(6)-Ib贡献增加。
**3.4 耐药类别与机制分布**
耐药组以氨基糖苷类耐药基因（32.9%）和四环素耐药基因（28.9%）为主，两者合计占比过半；多药耐药基因亦占显著比例（19.3%）。耐药机制以靶点改变（58.2%）和靶点保护（26.8%）为主导，提示耐药主要通过抗生素靶点的修饰而非药物降解或外排实现。酶促灭活机制占8.4%，外排系统占2.9%。
**3.5 基因组背景支持耐药基因的潜在移动性**
4条含耐药基因的contig显示与潜在移动性相容的特征。样本1中，tet(Q)位于被MOB-Recon和geNomad分类为质粒的环状contig上，含repA基因及IS66家族转座酶基因。样本4中，APH(3’)-IIIa亦位于质粒样环状contig上，含质粒重组蛋白基因和MOBV松弛酶基因；同样本中另一tet(Q)基因上游约5.4 kb处存在多个接合转移相关基因（traO、traN、traM、traJ、traG、traD）及松弛酶基因。样本3中，tet(Q)和ermF位于同一染色体contig上，IS30家族转座酶基因紧邻ermF上游。这些发现表明部分耐药决定因子存在于与潜在传播相容的基因组环境中，但活跃的基因转移超出了本研究范围。
**四、讨论与结论**
本研究的核心贡献在于将宏基因组测序和耐药基因谱分析纳入供体-受者选择与风险评估的信息来源。研究鉴定出涉及四环素和氨基糖苷类等临床相关抗生素类别的耐药决定因子，存在于肠道微生物群主要成员中，其中部分处于潜在可移动的基因组环境中，即便在已通过严格筛选的供体中亦不例外。四环素耐药基因tet(Q)和tet(W)的高流行率及其分别与脆弱拟杆菌和长双歧杆菌的关联，再次印证了这些分类群作为人肠道四环素耐药性主要储库的作用。ermF的高丰度及其与脆弱拟杆菌的关联进一步凸显了该物种作为耐药决定因子储库的地位。值得注意的是，样本3中tet(Q)与ermF共存于含IS30家族转座酶的染色体背景下，与拟杆菌接合转座子（如CTnDOT家族）的耐药结构特征相似。虽然移动性评估显示部分耐药基因处于潜在可转移的基因组环境中，但主动水平基因转移的验证超出了本研究范畴。研究人员指出，耐药基因谱分析可作为供体-受者评估的补充层级而非排除标准，当鉴定出临床相关耐药决定因子时，可考虑参照医疗机构碳青霉烯耐药革兰阴性菌监测指南进行进一步调查。未来整合供体-受者宏基因组谱分析、菌株追踪及临床结局的纵向研究，将有助于明确供体耐药特征对FMT临床效果的影响。总体而言，本研究为微生物群生物库的实施提供了可行框架，并强调宏基因组分析作为FMT常规生物安全筛查补充手段的潜力。
