《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Hepatitis B virus protein X promotes survival and loss of hepatocyte identity in a differentiated human liver organoid system
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乙型肝炎病毒（HBV）感染尽管已有有效疫苗和抗病毒治疗，仍是重大全球健康负担，全球约2.54亿人慢性感染。慢性HBV感染是肝细胞癌（HCC）的主要危险因素，可使风险增加至30倍，并占全球肝癌相关死亡的50%以上。HBV被认为通过持续病毒复制与宿主免疫应答之间的
乙型肝炎病毒（HBV）感染尽管已有有效疫苗和抗病毒治疗，仍是重大全球健康负担，全球约2.54亿人慢性感染。慢性HBV感染是肝细胞癌（HCC）的主要危险因素，可使风险增加至30倍，并占全球肝癌相关死亡的50%以上。HBV被认为通过持续病毒复制与宿主免疫应答之间的复杂相互作用促进肝癌发生，其中病毒蛋白HBx通过广泛调控肝细胞功能驱动致癌过程。然而，由于现有模型的局限性，HBx在肝癌发生中的分子机制仍未完全阐明。本研究利用成人肝来源的类器官系统，首先实施并表征了一种促进更成熟肝细胞样细胞产生的分化培养基，并利用多个供体来源的类器官系和互补表达策略，系统研究了HBx表达水平、供体背景及蛋白标签对HBx活性的影响。研究人员证明，HBx重塑肝细胞身份和凋亡信号以促进肝细胞存活。该基于类器官的平台为阐明HBx介导的HBV持续感染和肝脏肿瘤发生机制提供了相关系统。
背景与目的：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）慢性感染仍是全球重大公共卫生负担，全球约2.54亿人慢性感染，可使肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）风险增加至30倍，占全球肝癌相关死亡的一半以上。HBV通过持续炎症、病毒基因组整合及病毒蛋白表达等多种机制促进肝癌发生。HBx蛋白由HBV基因组最小的开放阅读框编码，可增强cccDNA转录、调节宿主信号通路，且其编码区常整合至宿主基因组中，持续表达。然而，HBx在肝癌发生中的分子机制尚不完全清楚，且现有模型——如肝癌细胞系、原代人肝细胞（PHH）、诱导多能干细胞来源肝细胞样细胞及动物模型——分别存在染色体不稳定、快速去分化、供体差异、胎样转录特征或物种差异等局限。成人肝来源的类器官系统能够长期扩增、保持遗传稳定性并再现肝组织的部分关键特征，但向成熟肝细胞样细胞高效分化的培养条件仍有待优化。因此，研究人员利用成人肝来源的类器官，通过改进分化条件和多种HBx表达策略，系统研究了HBx对肝细胞身份和存活的影响。该研究发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。
主要技术方法：研究人员从成人肝脏组织分离干细胞并建立类器官，使用增强分化培养基（DM+）将类器官分化为肝细胞样器官（HLO）。慢病毒载体用于构建稳定转导的类器官系，包括cognate HBx启动子驱动的组成型表达系统，以及Tet-On诱导型表达系统（分别带V5或EGFP标签），并在多个供体来源的类器官系中进行。利用3′ mRNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）评估转录组变化；利用ATAC-seq分析染色质可及性；使用高内涵显微镜结合免疫荧光定量HBx、活化caspase 3/7和CYP3A4；使用PETCM触发caspase 9依赖的凋亡；使用TCGA肝癌队列RNA-seq数据进行临床样本验证。
研究结果：
1. DM+条件促进生成分化增强的肝细胞样类器官：研究人员将成人肝类器官在扩增培养基（EM）中培养后，分别在DM和DM+中分化14天。形态学上DM+类器官出现更明显的颜色加深和压实；转录组分析显示，DM+类器官的肝细胞基因集富集显著增加，并与原代人肝组织样本聚类接近，而DM类器官未出现该富集。免疫荧光显示DM+类器官强表达成熟肝细胞标记物，下调SOX9和AFP，糖原储存能力增强。因此，DM+能够更稳定地产生分化成熟的肝细胞样类器官。
2. 外源表达HBx在DM+-HLO中产生抗凋亡和去分化转录特征：研究人员构建了cognate HBx启动子驱动的2xFlag-HBx慢病毒载体并转导类器官，RNA-seq共鉴定293个差异表达基因（DEGs），其中上调120个、下调173个。GSEA显示HBx表达导致凋亡相关基因集以及肝功能相关基因集（如代谢、解毒、补体和凝血因子合成）显著负富集。TCGA队列分析也表明HBV感染样本中凋亡和肝功能基因集下调，HBx表达与TERT表达呈正相关，与免疫相关基因表达呈负相关。随后建立Tet-On诱导系统，在分化后的DM+-HLO中诱导HBx表达24小时，鉴定出243个DEGs，同样呈现凋亡和肝功能通路负富集。ATAC-seq分析发现610个差异可及染色质区域（DARs），其中68%在HBx表达后可及性降低，这些区域主要位于远端调控区，富含AP-1、FOX家族和HNF4α转录因子结合基序，并与ENCODE中FOSL2、FOXA2、FOXA3、FOXO1和HNF4α的结合位点存在重叠。
3. 外源表达HBx在DM+-HLO中减弱凋亡诱导：在Tet-On系统中，HBx表达24小时后，研究人员用PETCM通过caspase 9依赖机制诱导凋亡。高内涵单细胞成像显示，PETCM处理产生caspase 3/7高表达的凋亡细胞群，而这些细胞主要为HBx低表达亚群；HBx高表达细胞的caspase 3/7活化水平显著降低。按凋亡特征（caspase 3/7活性、细胞核形态等）分类后，凋亡细胞中HBx丰度显著低于非凋亡细胞。在凋亡细胞群体内部，HBx高表达细胞的caspase 3/7活性仍低于HBx低表达细胞。这表明HBx在单细胞水平直接与凋亡抑制相关。
4. HBx表达导致肝细胞身份丧失和逃避凋亡：RNA-seq显示HBx表达显著下调CYP3A4等肝细胞成熟标记基因。单细胞成像分析显示，CYP3A4高表达细胞主要来自HBx低表达细胞群；在成熟肝细胞区室中，HBx高表达细胞的CYP3A4强度显著低于HBx阴性细胞。功能实验中，分化后的DM+-HLO在诱导HBx后转入EM并持续暴露于PETCM，HBx表达类器官的总面积持续增加，而未诱导HBx的类器官增殖停滞；HBx表达类器官的总体活力和增殖能力更高，且CYP3A4表达水平更低。这些结果说明HBx通过促进肝细胞去分化并抑制凋亡，为HBx表达细胞提供存活优势。
讨论与结论：讨论指出，HBx在凋亡中的作用存在长期争议，不同肝癌细胞系中曾报道促凋亡或抗凋亡功能，而本研究在分化的人肝细胞类器官中支持HBx主要发挥抗凋亡作用。HBx在Tet-On诱导系统中主要定位于细胞质，但核内信号强度更高，提示其可能通过与染色质相关调控复合物作用来改变宿主基因表达。ATAC-seq结果显示HBx广泛重塑远端调控区的染色质可及性，且DARs富集于HNF4α、FOX和AP-1等与肝细胞分化和应激反应相关的转录因子结合基序，支持HBx间接重编程表观状态的机制。该模型的局限性在于缺乏免疫细胞、肝星状细胞、内皮细胞和Kupffer细胞等非实质细胞，因此不能完全模拟免疫微环境，未来需通过共培养系统补足。
研究结论：总之，研究人员的发现支持一个模型：HBx是肝细胞状态的核心调节因子，通过将细胞存活与谱系保真度解偶联，从而参与HBV相关HCC的发病机制。利用生理相关的成人肝类器官系统，研究人员证明HBx驱动的凋亡抑制和肝细胞身份丧失在供体、标签策略和表达水平中一致存在。这些转录组变化伴随着远端调控元件染色质可及性的广泛重塑，富含调控肝细胞分化和应激反应的关键转录因子网络。未来工作需确定与HBx相互作用的染色质相关蛋白复合物，以阐明其如何间接重编程宿主表观和转录状态。尽管这些效应在体内可能进一步受肝微环境影响，该研究定义了HBx功能的肝细胞内在框架，并为病毒扰动上皮状态如何导致肝肿瘤发生提供了机制见解。
