毕赤酵母中自组装抗菌肽纳米颗粒的高效生产与发酵条件优化

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Production of antimicrobial peptides fused to a nanoparticle-forming polypeptide using Pichia pastoris

　　

摘要

抗菌肽是有前景的传统抗生素替代品，但其生产仍面临挑战，原因包括从天然来源回收率低、化学合成成本高以及细菌表达系统中的毒性相关限制。基于酵母的平台为重组抗菌肽的生产提供了可扩展且具有生理耐受性的宿主。在此，我们使用毕赤酵母生产融合至自组装多肽纳米颗粒的抗菌肽。设计了两个构建体，aurein 1.2–CSB 和 myxinidin–CSB，通过将抗菌肽融合到能自组装成蛋白质纳米颗粒的三嵌段多肽中。系统评估了包括甘油和甲醇浓度及pH在内的培养和诱导参数以提高产量。允许在甲醇诱导前大量积累生物量，并结合允许培养基酸化至约pH 3，增加了产量。在这些条件下，和产量分别增加了最高35.3倍和5.5倍，达到35.95 ± 19.05 mg/L和12.96 ± 5.75 mg/L。纯化的多肽自组装成纳米颗粒，通过原子力显微镜和动态光散射得到证实。形成了杆状纳米颗粒，平均高度为3.55 ± 0.38 nm，而和形成了球状纳米颗粒，平均高度分别为9.79 ± 1.56 nm和9.28 ± 0.99 nm。为了初步评估生物功能，使用荧光测定法对重组多肽对大肠杆菌进行评估。膜完整性通过基于SYTO 9和碘化丙啶染色的活/死细菌活力测试进行评估，同时用Hoechst染色细菌DNA。含有表达融合蛋白的培养上清液和纯化的纳米颗粒均显示出保持的抗菌活性。总之，这些发现确立了在毕赤酵母中高效生产自组装基于抗菌肽的蛋白质纳米颗粒的关键参数，并为它们的进一步开发和功能表征提供了可扩展平台。

关键点

• 甲醇诱导前的高生物量和pH约3改善了生产。

• 纯化的多肽保留了自组装成纳米颗粒的能力。

• 纳米颗粒对大肠杆菌显示出初步的抗菌活性。

图形摘要