《Biotechnology and Bioengineering》：Process Analytical Technology (PAT) for Continuous Purification of mRNA via Precipitation and Tangential Flow Filtration
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信使核糖核酸（mRNA）治疗药物的连续下游加工需要可放大、稳健且能够从体外转录混合物中去除产物相关和过程相关杂质的纯化策略。基于沉淀的纯化 coupled with 切向流过滤（TFF）近期已被证明是一种无需色谱的连续mRNA纯化途径。然而，该方法的实施需要实
信使核糖核酸（mRNA）治疗药物的连续下游加工需要可放大、稳健且能够从体外转录混合物中去除产物相关和过程相关杂质的纯化策略。基于沉淀的纯化 coupled with 切向流过滤（TFF）近期已被证明是一种无需色谱的连续mRNA纯化途径。然而，该方法的实施需要实时监测策略，以区分富含产物的沉淀相与富含杂质液相，以及整个集成过程中与相相关的传输行为。在本研究中，研究人员开发了一种相位分辨过程分析技术（PAT）和停留时间分布（RTD）框架，用于通过PEG/NaCl沉淀和顺序TFF进行连续mRNA纯化。在线紫外-可见光谱和基于LED的光密度测量被同时用于将核酸吸光度与由悬浮mRNA沉淀引起的浊度响应分离开来。使用溶解和沉淀示踪剂进行的RTD实验揭示了管式沉淀器和TFF模块中与相相关的传输行为，并通过轴向扩散模型和串联槽模型进行了量化。在集成运行期间，在线PAT捕获了启动、稳态和洗脱行为，而稳定的跨膜压（TMP）表明运行过程中未观察到明显的膜污染。本研究表明，基于沉淀的连续mRNA纯化可以通过相位分辨监测和基于RTD的过程理解得到加强，为核酸治疗药物的连续下游加工过程的稳健开发提供了框架。
论文解读：基于PAT的连续mRNA沉淀-切向流过滤纯化过程监控与流场表征
一、研究背景与问题
信使核糖核酸（mRNA）治疗药物因其可通过编程性蛋白质表达实现多种治疗功能，已成为极具潜力的治疗平台。然而，mRNA的分子特性，如大尺寸、易降解以及结构敏感性，给其制造过程带来了巨大挑战。体外转录（IVT）粗混合物中目标mRNA常与残留蛋白、质粒DNA（pDNA）、双链RNA（dsRNA）等结构和性质相似的杂质共存，去除这些杂质的同时需保持mRNA的纯度和完整性。当前主流的mRNA纯化平台依赖于oligo(dT)亲和色谱、离子交换或多模式色谱以及过滤步骤，但这些方法存在选择性有限、对洗脱条件敏感、膜污染风险以及操作窗口窄等局限性，并非普遍稳健。为突破上述瓶颈，沉淀与膜分离耦合的策略被探索用于生物制品纯化。Royo等报道了以聚乙二醇（PEG）/氯化钠（NaCl）沉淀直接从粗IVT混合物中纯化mRNA的无色谱方法，并将其与顺序TFF耦合，构建了连续纯化平台。然而，将该平台推向规模化实施，需要基于质量源于设计（QbD）的过程理解，以及实时监测和控制策略来支持稳健运行和一致的产品质量。由于富含产物的沉淀相与富含杂质的液相均含有核酸类物质且光学信号重叠，传统单一波长UV检测难以区分二者，因此亟需一种相位分辨的PAT体系。
二、研究目标与主要贡献
本研究旨在开发一种集成框架，用于连续沉淀法mRNA纯化过程中的相位分辨监测与流动表征。研究人员在Royo等所报道的沉淀-TFF平台基础上，引入在线紫外-可见（UV-Vis）光谱和光密度（OD）测量，同时跟踪溶解杂质和沉淀mRNA。通过停留时间分布（RTD）实验和机理建模，量化了各单元操作中与相相关的传输行为，并结合可编程逻辑控制器（PLC）自动化与MATLAB控制，实现了集成系统的实时过程理解与稳健运行。
三、关键技术与方法
研究中采用了以下几项关键技术：1）在线UV-Vis光谱和LED基OD传感器，分别用于溶解相（260 nm吸收）和沉淀相（350 nm散射及OD）的同步监测；2）RTD示踪实验，对管式沉淀器采用阶跃示踪，对TFF模块采用脉冲示踪；3）轴向分散模型和串联槽（TIS）模型，用于量化非理想流动参数；4）PLC自动化系统与MATLAB监控界面，用于协调泵、压力、温度控制及数据采集。实验所用mRNA为来自Arranta Bio（Recipharm AB, USA）的粗IVT Fluc mRNA（1 g/L）。连续平台取消了单元操作之间的中间收集罐，采用Y型连接器和附加泵实现全连续流。
四、主要研究结果
3.1 PAT开发：通过宽波长UV-Vis光谱分析，发现沉淀浓度增加时>300 nm区域吸收增强，源于悬浮固体的光散射。选定350 nm作为浊度敏感波长。以已知浓度mRNA沉淀进行校准，在比色皿模式和流动模式下，350 nm吸光度及OD信号均与沉淀浓度呈强线性相关（R2≈0.94–0.99）。260 nm信号因受mRNA和溶解核苷酸共同贡献而快速饱和，限制了其在固相定量中的应用；但在渗透液中无沉淀时可直接定量溶解杂质。组合使用260 nm和350 nm/OD可区分溶解相与沉淀相，并为过程反馈提供信号基础。
3.2 RTD研究：在管式沉淀器中，OD和A-350归一化穿透曲线高度重合，而A-260响应相对A-350延迟约2 min，表明沉淀相和溶解相具有不同的传输行为。轴向分散模型拟合得到A-260平均停留时间30.6 min，Peclet数约300，轴向分散系数4.3×10?? m2/s；A-350平均停留时间27.8 min，Peclet数500，轴向分散系数2.52×10?? m2/s，验证了固相与液相在静态混合器管式反应器中的差异输运。在TFF模块中，截留液内OD和A-350信号一致反映保留的沉淀相；渗透液以A-260监测溶解杂质，其脉冲响应显示近活塞流行为（N=2–3，平均停留时间2.2–3.1 min），远短于截留液，表明膜对两相具有选择性分配作用。
3.3 全集成连续运行：将整个沉淀-TFF滑组连续运行75 min。在线信号显示管式沉淀器出口A-350先上升，随后TFF-1截留液放流线A-260上升，两者均在约45–60 min达到稳定平台。稳态时沉淀器出口校准浓度约0.7 mg/mL，TFF-1截留液放流约为0.1 mg/mL，与洗涤流稀释一致。跨膜压（TMP）保持稳定，未见明显膜污染。停运时A-350先于A-260下降，反映不同停留时间特征。离线质量分析显示最终产物获得92%过程回收率、95%纯度、93%完整性、低dsRNA含量，pDNA和残留蛋白低于检测限或规格限。
五、总结与结论
研究人员建立了一种相位分辨的PAT框架，通过UV-Vis和OD联用实时区分连续mRNA沉淀纯化中的溶解杂质和沉淀产物，通过RTD实验和模型量化了各单元操作及集成系统中的相位依赖性传输。改造后的滑组消除了中间收集罐，降低了物料停留时间，结合PLC自动化和PAT监控，实现了稳定、可重复的连续纯化。该研究证明了沉淀法纯化可从可行性研究推进到工程实施，为QbD对齐的过程开发与CMC就绪制造提供了实时监控和稳健运行的基础，为大规模、低成本的mRNA治疗连续制造指明了可行路径。
