《Food and Function》：The intake of tomato juice and lycopene modulates expression of human plasma microRNAs: a randomized, double-blind, parallel-group studyOpen Access
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MicroRNAs（miRNAs）通过靶向特定mRNAs调控生物学反应。尽管miRNA表达受疾病和生活方式因素影响，但食物摄入对人类miRNA表达的影响尚不清楚。本研究探讨了番茄汁（T）及其所含番茄红素（lycopene）对人类miRNA水平的影响。这项随机、
MicroRNAs（miRNAs）通过靶向特定mRNAs调控生物学反应。尽管miRNA表达受疾病和生活方式因素影响，但食物摄入对人类miRNA表达的影响尚不清楚。本研究探讨了番茄汁（T）及其所含番茄红素（lycopene）对人类miRNA水平的影响。这项随机、双盲、安慰剂对照试验纳入了22名健康日本个体。研究人员让参与者连续12周饮用T或去除番茄红素的番茄汁（LDT），并使用下一代测序（next-generation sequencing）评估其全面血浆miRNAs。T的摄入上调了14种miRNAs的表达，下调了21种miRNAs的表达。T与LDT之间的差异分析显示，T中所含的番茄红素上调了三种miRNAs（miR-28-5p、miR-128-3p和miR-186-5p）的表达，并下调了两种miRNAs（miR-197-3p和miR-92a-3p）的表达。这些数据首次证明番茄汁和番茄红素摄入可能改变人类miRNA表达。
一、研究背景与目的
MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约22个核苷酸的小型非编码RNA，能够进入体循环并充当细胞间通讯的功能介质。它们通过与mRNA的3′非翻译区互补序列结合，抑制翻译并促进mRNA降解，从而调控超过60%蛋白质编码基因的表达。越来越多的证据表明，miRNAs参与癌症和心血管疾病等多种疾病的发生与发展。因此，血液中miRNA表达水平的改变可作为多种疾病及生活方式相关障碍诊断或监测的潜在生物标志物。
miRNA表达谱不仅受病理条件调节，也受食物和膳食因素的影响。在小鼠模型中，大豆苷元（daidzein）和槲皮素（quercetin）等黄酮类化合物被发现可调节特定的血浆miRNAs。针对洋葱成分的临床研究表明，持续摄入洋葱可显著改变人类血浆中三种miRNAs的表达水平。此外，针对地中海饮食的研究揭示，为期一年的膳食干预能显著调节循环miRNA表达谱。尽管近期研究显示洋葱、核桃和葡萄柚等特定食物的摄入可调节人类循环miRNA谱，但研究人员对食物诱导的miRNA改变的理解仍然有限。
番茄是一种广泛消费的蔬菜，常用于果汁、酱料和番茄酱等加工制品。大规模队列研究发现，番茄摄入与降低心血管疾病和癌症发病率以及降低总体死亡率相关。这些健康促进作用归因于番茄中丰富的营养成分，包括维生素C、钾、可溶性膳食纤维以及β-胡萝卜素（β-carotene）、八氢番茄红素（phytoene）和六氢番茄红素（phytofluene）等类胡萝卜素。特别是番茄含有大量的番茄红素（lycopene），这是一种重要的类胡萝卜素。番茄红素作为一种对抗生活方式相关疾病的功能分子备受关注，对肥胖、糖尿病、癌症、心血管疾病、勃起功能障碍、肾损伤和精神障碍均表现出保护作用。然而，其他番茄类胡萝卜素，尤其是无色类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素，也可能贡献于这些健康促进作用。有趣的是，热处理后的番茄汁中番茄红素的生物利用度高于生番茄，因此番茄汁可能增强番茄红素的生理功能。尽管虾青素（astaxanthin）的膳食摄入已被报道可调节人类miRNA表达，但番茄汁和番茄红素对循环miRNA表达的影响仍不明确。
因此，本研究旨在探讨持续摄入番茄汁和番茄红素对人类血浆中循环miRNAs行为的影响。
二、研究设计与结论
这是一项随机、双盲、安慰剂对照研究，试验期为2019年11月20日至2020年2月12日。研究对象为22名完成试验的健康日本志愿者（番茄汁T组n=11，去除番茄红素的番茄汁LDT组n=11），年龄20-65岁，血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平介于40-60 mg dL-1之间。研究人员将参与者随机分为两组，分别每天饮用番茄汁（T，每罐含13.5 mg番茄红素）或去除番茄红素的番茄汁（LDT，每罐含1.3 mg番茄红素），持续12周。研究人员在干预前后采集血浆样本，利用下一代测序（NGS）技术全面检测miRNA表达谱。
研究得出以下结论：番茄汁摄入显著改变了35种miRNAs的表达水平，其中14种上调，21种下调。通过比较T组和LDT组从基线到干预结束的变化值（ΔRead counts），研究人员鉴定出五种特异性响应番茄红素摄入的miRNAs：miR-28-5p、miR-128-3p和miR-186-5p表达上调，miR-197-3p和miR-92a-3p表达下调。这五种miRNAs的联合ROC曲线下面积（AUC）达到1.0，显示出极高的区分能力。这是首次阐明番茄汁和番茄红素对miRNA表达的调节作用，提示这些miRNAs可能作为潜在的摄入生物标志物。
三、关键技术方法
- 1.
研究设计与分组：采用随机、双盲、安慰剂对照、平行组设计。研究对象为22名来自日本的健康志愿者（T组n=11，LDT组n=11）。
- 2.
干预措施：参与者每日饮用160克番茄汁（T，含13.5 mg番茄红素）或去除番茄红素的番茄汁（LDT，含1.3 mg番茄红素），持续12周。
- 3.
样本处理与测序：使用柠檬酸钠真空采血管采集血浆，离心后提取总RNA（含miRNAs）。利用TruSeq Small RNA Kit构建文库，经5% PAGE凝胶进行大小筛选，使用Illumina MiniSeq平台进行下一代测序（NGS）。
- 4.
数据分析：原始读数采用DESeq方法分析，文库大小归一化为每百万读数（counts per million）。使用非参数Mann-Whitney U检验比较T组与LDT组之间miRNA表达变化的差异。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估miRNAs的区分能力。
- 5.
靶基因预测与富集分析：利用miRDB和TargetScan Human 8.0数据库预测miRNA靶基因，使用ShinyGO 0.85进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，显著性标准为错误发现率（FDR）< 0.05。
四、研究结果
1. 持续摄入番茄汁对全面miRNA表达的影响
研究人员对22名完成试验的参与者进行分析，T组和LDT组各11人，两组基线特征无统计学差异。在T组中，共检测到141种共同miRNAs（干预前后均在半数以上参与者中检出），LDT组为146种，两组共有134种miRNAs纳入后续分析。通过DESeq方法比较T组干预前后的miRNA表达变化，火山图分析显示，番茄汁摄入显著改变了35种miRNAs的表达，其中14种上调（如miR-423-5p、let-7e-5p、let-7b-5p等），21种下调（如miR-22-3p、miR-26b-5p、miR-93-5p等）。
2. 番茄汁组与去除番茄红素番茄汁组的miRNA表达比较分析
研究人员分别对T组和LDT组进行DESeq差异表达分析。结果显示，LDT组有47种miRNAs发生显著改变，T组有35种，其中32种重叠。这些重叠的miRNAs受番茄汁摄入调节，但与是否含有番茄红素无关。三种miRNAs（miR-501-3p、miR-26a-5p和miR-425-5p）仅在T组中发生改变，但在试验终点时，这些miRNAs在T组与LDT组之间未表现出显著差异。由于Q值校正较为保守，且食物诱导的miRNA变化通常小于疾病相关的显著改变，加之个体间基线miRNA水平存在较大变异，研究人员转而聚焦于干预前后miRNA表达变化的差值（ΔRead counts）分析。
3. 基于试验食品摄入前后表达差异的番茄红素诱导miRNA表达变化分析
通过计算每位参与者每种miRNA从基线到干预结束的变化值（ΔRead counts），并在T组与LDT组之间进行比较，研究人员鉴定出五种显著差异的miRNAs。与LDT组相比，T组中miR-28-5p、miR-128-3p和miR-186-5p显著升高，而miR-197-3p和miR-92a-3p显著降低。由于番茄红素是T与LDT之间的主要成分差异，这些miRNAs被认为是潜在的番茄红素响应候选miRNAs。ROC分析显示，单个miRNA的AUC值在0.752至0.884之间，其中miR-197-3p的区分能力最高（AUC=0.884），而将这五种miRNAs联合使用时，AUC达到1.0。
4. 基于各miRNA预测靶基因的富集分析
研究人员利用miRDB和TargetScan 8.0数据库预测五种miRNAs的潜在靶基因，并对两个数据库共有的靶基因进行KEGG通路富集分析。miR-128-3p的靶基因富集于“脂肪细胞中脂肪分解的调控”、“长寿调节通路-多物种”和“皮质醇合成与分泌”。miR-186-5p的靶基因与“EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性”、“黑色素瘤”和“HIV-1病毒生命周期”相关。miR-197-3p的靶基因涉及“多梳抑制复合物”和“泛素介导的蛋白水解”。miR-92a-3p的靶基因与“GnRH分泌”、“FoxO信号通路”和“肌醇磷酸代谢”有关。对于被至少三种miRNAs共同靶向的24个基因进行富集分析，鉴定出“长寿调节通路-多物种”、“胰岛素抵抗”和“蛋白聚糖与癌症”等关键通路。
五、讨论与结论总结
讨论部分：本研究的讨论指出，这是首次证明番茄汁摄入可调节人类血浆中35种miRNAs的表达，且这些miRNAs的表达模式与之前报道的核桃、葡萄柚和洋葱摄入引起的改变无重叠，提示它们可能是番茄汁摄入的特异性响应。通过比较番茄汁（T）与去除番茄红素的番茄汁（LDT）组，研究人员鉴定出五种响应番茄红素的miRNAs（miR-28-5p、miR-128-3p、miR-186-5p、miR-197-3p和miR-92a-3p），其表达模式同样与其他食物摄入无重叠，表明这些波动可能是对番茄汁中番茄红素的特异性反应。功能分析显示，这些miRNAs与癌症、神经保护、糖尿病和心血管疾病等相关。例如，上调的miR-28-5p具有肿瘤抑制作用，而下调的miR-92a-3p已知可促进癌症进展并通过靶向PTEN激活PI3K信号，这与番茄红素抑制PI3K表达的既往研究一致。miR-186-5p的上调与改善血糖控制和胰岛素分泌相关，而miR-92a-3p的下调可能有助于心血管保护。五种miRNAs的联合ROC分析AUC达1.0，提示其作为番茄红素摄入的新型生物标志物组合具有极高潜力。通路富集分析指向PI3K/Akt/mTOR信号轴，并鉴定出“长寿调节通路-多物种”和“胰岛素抵抗”等通路，与流行病学数据和临床报告一致。然而，研究人员强调，由于样本量较小、研究人群仅限于低HDL-C水平的日本个体，且LDT对照可能同时去除了其他脂溶性活性成分，这些发现需要在更大规模、更多样化的人群中进行验证，并需进一步的功能研究来阐明因果关系。
结论部分：研究人员开展了一项为期12周的随机、双盲、安慰剂对照干预试验，评估了摄入番茄汁及番茄汁中番茄红素后血浆miRNA谱的变化。研究结果显示，番茄汁摄入后35种miRNAs的表达水平发生显著改变，而五种特定的miRNAs（miR-28-5p、miR-128-3p、miR-186-5p、miR-197-3p和miR-92a-3p）表现出与番茄红素摄入相关的显著变化。此外，番茄红素响应miRNAs的ROC分析确定miR-197-3p在两组之间具有最高的区分能力。然而，由于本研究样本量较小，研究结果不足以进行更广泛的推广，需要通过大规模试验进行进一步验证。接下来，对番茄汁中番茄红素改变的miRNAs的预测靶基因进行通路富集分析，确定了关键的生物学过程，如“长寿调节通路-多物种”和“胰岛素抵抗”。虽然本研究未对这些miRNAs在番茄红素生理效应中的直接参与进行功能验证，但研究结果为通过番茄汁摄入番茄红素的健康促进作用提供了有价值的见解。这是首次阐明番茄汁和番茄汁中番茄红素对miRNA表达的调节作用，提示这些miRNAs可能作为潜在的摄入标志物。
